向海雁雁掌黄皮多肽的提取及抗氧化活性

高博，赵宇，孙尧，崔本海，高冷，高晓晨

1.长春工业大学化学与生命科学学院（长春 130012）；2.长春中医药大学吉林省人参科学研究院（长春 130117）；3.通榆县向海崔成大雁养殖有限公司（白城 137200）

雁掌黄皮为大雁脚掌及足蹼上的黄色表皮。向海雁（Anser cygnoides）作为吉林省特有物种，常年生活在吉林省通榆县向海自然保护区内，2015年其被美国国立生物技术信息中心认定为新物种[1]。向海雁浑身是宝，雁骨、雁血、羽毛都具有一定的经济价值。向海雁肉质蛋白含量高、热量低、胆固醇低，作为优质的肉类来源深受人们的追捧。吉林省作为向海雁养殖基地之一，每年宰杀量超过30万只。大量的向海雁雁掌黄皮则是作为食品加工副产物被丢弃，造成极大的生物资源浪费与环境污染。

生物活性肽也称功能性肽，由2~20个氨基酸残基组成，通常由蛋白经过酶解得到。据报道，现已开发出具有抗冻、抗氧化、降血压等活性的生物肽，在食品、保健品方面展现出良好的应用前景[2]。研究表明，从鸭皮、鹅皮等动物表皮中所提取分离得到的蛋白和多肽均有一定的抗氧化活性[3-4]。目前国内外对向海雁加工副产物的研究报道十分少见，对其没有深入研究。

此次试验以向海雁雁掌黄皮原料，选择最适蛋白酶对其进行酶解，利用单因素试验与正交试验确定其适宜提取工艺，并利用凝胶排阻色谱测定向海雁雁掌黄皮多肽相对分子质量的分布，进而对其抗氧化活性进行研究，为向海雁雁掌黄皮及向海雁系列产品开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜向海雁雁掌黄皮，由吉林省白城市通榆县向海崔成大雁养殖有限公司提供；胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶，由合肥博美生物科技有限责任公司提供；MDA试剂盒、SOD试剂盒，由南京建成科技有限公司提供；其他试剂，均为国产分析纯。

UV-3000PC紫外分光光度计（杭州俊升科学器材有限公司）；LGJ-30冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；TGL16M高速冷冻离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；PH-050A型恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 向海雁雁掌黄皮蛋白提取

提取参考Woo等[5]和聂新艳[6]方法，稍作修改。向海雁宰杀后，将其掌皮完整剥落，剪去指甲，除去可见脂肪，洗净备用。将向海雁雁掌黄皮剪成2 cm×2 cm的小块，处理后的向海雁雁掌黄皮采用石油醚进一步除去脂肪，将脱脂后的向海雁雁掌黄皮用去离子水多次冲洗，吸干多余水分放入烘箱温度置于60 ℃干燥至恒重，利用粉碎机对其进行粉碎处理。取干燥的向海雁雁掌黄皮粉末，与去离子水按照1∶15（g/mL）的料液比混匀，称取一定量的蛋白酶加入其中。在一定温度、pH条件下酶解一定时间，酶解结束后在100 ℃下灭酶10 min，待蛋白液冷却后过滤，在4 000 r/min的条件下离心30 min，取上清液冷冻干燥，得到向海雁雁掌黄皮蛋白。

1.2.2 向海雁雁掌黄皮多肽最佳酶解工艺研究

1.2.2.1 向海雁雁掌黄皮多肽蛋白酶的选择

选取胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶等5种酶，在其最佳酶解条件下对预处理后的向海雁雁掌黄皮进行水解。5种蛋白酶的最适条件[7-8]如表1所示，在每种蛋白酶最佳酶解条件下，利用凯氏定氮法和甲醛滴定法来测定水解度[9-10]。

表1 各种蛋白酶的水解条件设计表

1.2.2.2 向海雁雁掌黄皮多肽单因素试验

称取10 g向海雁雁掌黄皮干燥样品置于盛有150 mL的去离子水烧杯中，加入不同质量（1 000，2 000，3 000，4 000和5 000 U/g）蛋白酶以不同pH（5.0，6.0，7.0，8.0和9.0）在不同的温度（40，45，50，55和60 ℃）条件下酶解一段时间（1，2，3，4和5 h）。将温度提升至100 ℃加热煮沸10 min，待蛋白酶完全灭活后，静置使其冷却后过滤再放入离心机中以4 000 r/min的速度离心30 min，取上清液，采用凯氏定氮法和甲醛滴定法测定水解度。

1.2.2.3 向海雁雁掌黄皮多肽酶解工艺优化正交试验

在单因素试验结果的基础上，以蛋白水解度为响应值（Y），选择蛋白酶添加量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）、pH（D）为自变量，进行四因素三水平的正交试验，试验设计因素水平见表2。

表2 酶解工艺正交试验设计因素水平

1.2.2.4 水解度测定

采用甲醛滴定法测定氨基氮含量[11-12]，采用凯氏定氮法[13-14]测定样品中总氮含量，按式（1）计算水解度。

1.2.3 向海雁雁掌黄皮多肽的相对分子质量分布测定[16]

采用分子排阻色谱法测定向海雁雁掌黄皮多肽的相对分子质量大小。取1 mg/mL的样品溶液，用0.22 μm的滤膜过滤后进色谱柱TSK gel 2000SWXL（300 nm×4.6 nm，4 μm）；流动相：0.1 mol/L的PBS+硫酸钠溶液；检测波长：280 nm；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。用核糖核酸酶（13 700 Da）、抑肽酶（6 500 Da）、胰岛素（5 808 Da）、人生长激素释放抑制因子（1 521 Da）、谷胱甘肽（307 Da）、亮氨酸（131 Da）作为相对分子质量校正标准[15-16]。以标准品的logMW及洗脱时间作标准曲线。

1.2.4 向海雁雁掌黄皮多肽的体外抗氧化活性研究

1.2.4.1 OH自由基清除率的测定

参照张雪娇等[17]的方法进行测定。每个样品3平行组，取平均值。按式（2）计算清除率。

式中：A0为蒸馏水代替过氧化氢溶液；A1为待测样品与硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸乙醇混合溶液；A2为蒸馏水代替样品溶液。

1.2.4.2 O2-自由基清除率的测定

参考方磊等[18]的方法进行测定。每个样品3平行组，取平均值。按式（3）计算清除率。

式中：V0为空白样，mL；V1为待测样品，mL。

1.2.5 血管内皮细胞保护作用

参照颜培华等[19]的方法建立大鼠血管内皮细胞损伤模型。将向海雁雁掌黄皮多肽按照50，100和200 mg/mL的剂量与模型细胞在37 ℃ 5% CO2的条件下培养24 h，收集对照组、模型组和低、中、高各组的上清液，按照测试盒说明书测定其MDA和SOD活力，考察向海雁雁掌黄皮多肽对血管内皮细胞的保护作用。

2 结果与分析

2.1 向海雁雁掌黄皮蛋白最佳酶解工艺研究

2.1.1 蛋白酶的确定

由图1可知，5种蛋白酶对向海雁雁掌黄皮蛋白的水解能力依次为中性蛋白酶＞胃蛋白酶＞碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞风味蛋白酶，选取水解度最高的单酶对向海雁雁掌黄皮蛋白进行水解，因此选择中性蛋白酶作为工具酶。

图1 不同蛋白酶的水解度

2.1.2 酶解工艺单因素试验结果

中性蛋白酶酶解向海雁雁掌黄皮蛋白的单因素试验结果如图2所示。由图2（A）可知，水解度随着蛋白酶的加入量呈上升趋势直至4 000 U/g时达到最高，继续加入蛋白酶出现下降趋势，可能是因为底物浓度不足影响反应的继续进行，继续增加加酶量，可能会过度酶解。由图2（B）可知，向海雁雁掌黄皮蛋白水解度随着提取时间的增长呈现先上升后下降的趋势，当提取时间为5 h时向海雁雁掌黄皮水解度达到最高，这表明随着酶解时间的延长，向海雁雁掌黄皮中蛋白与中性蛋白酶充分接触，利于向海雁雁掌黄皮水解度的提高。由图2（C）可知，水解度随温度的升高先上升后下降，在55 ℃时水解度达到最高，这可能是因为过高的温度会使蛋白酶稳定的分子构象被破坏，导致蛋白酶失活从而导致水解度下降。由图2（D）可知，水解度在pH 7时到达最高，pH过高或过低均会影响蛋白酶的活力，所以确定酶解时的pH为7。

图2 各因素对向海雁雁掌黄皮蛋白水解度的影响

2.1.3 向海雁雁掌黄皮多肽酶解正交试验

在单因素试验结果的基础上，以蛋白水解度为响应值（Y），选择蛋白酶添加量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）、pH（D）为自变量，进行L9(34)的正交试验，试验设计水平见表2，试验结果见表3，方差分析见表4。通过正交试验分析，4个因素对水解度的影响为A＞B＞C＞D。综合考虑，选择工艺A2B1C2D2。在此工艺条件下进行3次重复试验，水解度的平均值为28.07%，说明该工艺可用于向海雁雁掌黄皮多肽的实际生产。

表3 向海雁雁掌黄皮多肽正交试验设计及结果

表4 向海雁雁掌黄皮正交方差分析结果

2.1.4 向海雁雁掌黄皮多肽相对分子质量分布结果

由图3可知，向海雁雁掌黄皮多肽在280 nm处的保留时间在9.255~12.33 min，通过线性方程（y=-0.349 4x+7.246 6，R2=0.996 5）得出其相对分子质量在859~10 302 Da之间，主要集中在8 000 Da以下，此次试验制备得到的向海雁雁掌黄皮多肽符合具有生物活性多肽相对分子质量大小的范围。

图3 向海雁雁掌黄皮多肽凝胶排阻色谱结果

2.1.5 向海雁雁掌黄皮多肽抗氧化活性研究结果

分别对未酶解向海雁雁掌黄皮蛋白和向海雁雁掌黄皮多肽的·OH自由基清除率和O2-自由基清除率进行测定，结果如图4所示。向海雁雁掌黄皮多肽添加量低、中、高三个组分中，抗氧化能力的排名为高剂量组（12 mg/mL）＞中剂量组（8 mg/mL）＞低剂量组（4 mg/mL）；抗氧化活性的能力的大小随剂量的增长而增长，其中抗氧化活性最强是高剂量组（添加浓度为12 mg/mL），其羟基自由基的清除能力和超氧阴离子的清除能力分别为70.45%和72.68%。

图4 向海雁雁掌黄皮多肽各浓度抗氧化活性试验结果

2.1.6 向海雁雁掌黄皮多肽对血管内皮细胞的保护作用结果

血管内皮细胞广泛地分布在身体的每一部分，它是组成血管的第一道屏障。它具有调节血流、抑制血栓形成等功能，血管内皮细胞的损伤是引发部分疾病的诱因，而炎症反应、氧化应激以及冷损伤都能引起血管内皮细胞的损伤。MDA是脂质过氧化的最终代谢物质，能够引起细胞的损伤[20]。结果表明，模型组的MDA的含量显著上升，向海雁雁掌黄皮多肽各剂量干预组与模型组相比能够降低MDA含量，其中中、高剂量组细胞内MDA含量显著降低，但低剂量组无明显影响。SOD水平的高低可以反映出抗氧化能力的强弱，SOD水平越高，抗氧化能力越强，反之则弱[21]。结果显示，与对照组相比，模型组内皮细胞的SOD活力显著降低，与模型组比较各剂量多肽干预组SOD活力均显著上升。证明向海雁雁掌黄皮多肽具有抗氧化活性，能够对血管内皮细胞起到保护作用，为今后向海雁雁掌黄皮多肽抗氧化的应用与开发提供了理论依据。

3 结论

试验以向海雁加工副产物雁掌黄皮为原料，经过筛选确定利用中性蛋白酶对向海雁雁掌黄皮蛋白进行酶解。正交试验得到的酶解工艺为加酶量4 000 U/g、酶解温度55 ℃、酶解时间5 h、pH 7，在此条件下水解度为28.07%；向海雁雁掌黄皮多肽经凝胶排阻色谱测定，其相对分子质量主要集中在8 000 Da以下。并对向海雁雁掌黄皮多肽和未经酶解的向海雁雁掌黄皮蛋白进行抗氧化试验。结果表明，在体外抗氧化试验中，低、中、高剂量向海雁雁掌黄皮多肽的添加均有抗氧化活性。抗氧化活性排名为高剂量组＞中剂量组＞低剂量组，其中高剂量组的抗氧化活性最强，其羟基自由基的清除能力和超氧阴离子的清除能力分别为70.45%和72.68%；在对大鼠血管内皮细胞的保护试验中，低、中、高三个剂量组均能够降低模型细胞的MDA含量，增加SOD活性，能够对血管内皮细胞起到保护作用，说明向海雁雁掌黄皮多肽具有良好的抗氧化能力。因此，向海雁雁掌黄皮多肽可作为一种天然安全的抗氧化物质，应用于功能性食品、生物制药及化妆品等领域。