近红外光谱技术在粮食真菌毒素检测中的应用进展

邓 依

(四川宜宾五粮液集团公司质量检测中心，四川宜宾644007)

中国工程院食品安全重大咨询研究结果显示[1]：我国每年有3100多万公吨粮食在生产、储存、运输过程中被真菌污染，约占粮食总产量的6.2%。由于中国大部分地区气候温和，湿度较大，适宜真菌生长代谢，因而粮食容易受真菌污染并产生毒素。真菌毒素均有强毒性和致癌性，能够污染所有种类的食用和饲用农产品，已成为世界各国高度关注的食品安全热点问题[2]。据报道，粮食有害微生物镰刀菌属在收储前期产生较多，而中后期主要是以黄曲霉、寄生曲霉、青霉为主[3]。真菌毒素是典型的微生物毒素，是某些真菌在生长过程产生的引起人和动物病理变化和生理变异的次级代谢产物[4]。真菌毒素通常难以降解，能在广泛的pH值范围内存在，通过饮食或饲料，进入动物体内发挥其毒性作用，对人和动物的健康形成一系列不良影响[5]。如黄曲霉被认为是迄今发现的最强的天然致癌物质[6]，主要与肝癌的发生有关；脱氧雪腐镰刀菌烯醇具有很高的细胞毒性和免疫抑制性质，通常会引起人类急性中毒，导致呕吐、腹泻等现象较为普遍[7]，玉米赤霉烯酮具有类似雌激素效应的致毒作用，对人类以及动物生殖系统具有很大的损害[8]。有研究发现，发霉很严重的物质不一定有较高含量的真菌毒素，而那些看起来发霉不严重的材料可能含有大量的真菌毒素，因此，研究者们对霉菌的研究重心开始转移到真菌毒素上来，真菌毒素已经成为品质评定的指标之一[9]。

1 真菌毒素概况

1.1 真菌毒素的种类

真菌毒素主要分为3类，包括曲霉菌属：黄曲霉毒素、赭曲霉素、柄曲霉素；镰刀菌属：T-2毒素、呕吐类毒素、雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马毒素；青霉菌属：橘青霉素、展青霉素、红色青霉毒素、青霉酸等[10-13]。粮食中的真菌毒素，主要有黄曲霉毒素(Aflatoxin，ATF)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin，OTA)、桔霉素(Citrinin，CIT)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、伏马毒素(fumonisin，FUM)等[14]。

1.2 粮食真菌毒素的限值与检验方法

GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》[15]，对谷物、豆类等粮食作物中黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的限量作出了严格规定。检测粮食真菌毒素的方法有多种，且各种方法优缺点并存，比较常用的方法有酶联免疫法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法和荧光光度法等[16]。

近年来，真菌毒素的分析手段逐步向实时、快速、准确的方向转变。在此背景下，无损检测技术日益受到关注，在粮食真菌毒素检测中也越来越多的得以应用[17]。随着化学计量学的进一步发展，近红外光谱应用技术获得了很大进步，在农产品微生物检测等很多领域都得到了广泛应用，在低含量真菌和毒素定性、定量检测方面的研究开始涌现[18]。与通常需要高级技术能力的现有复杂色谱技术相比，近红外光谱分析方法通常不会耗费大量劳动力，不需要大量化学物质，并且可实现多组分同时检测、快速、无损，需要较少的技术培训和样品前处理[19-20]。

2 近红外光谱技术在粮食真菌毒素检测中的应用

2.1 近红外光谱技术概述

近红外光谱(near infrared spectroscopy,NIRS)是指波长在780～2526 nm，介于可见光区和中红外光区之间的电磁波，可细分为短波近红外区（SWNIR，780～1100 nm）和长波近红外区（SW-NIR，1100～2526 nm）。近红外光谱来源于分子振动对光的吸收，对应于有机分子中含氢基团的倍频与合频振动信息[21]。倍频和合频构成了近红外光谱的核心部分，而近红外光谱带的产生和属性取决于非谐性。非谐性最高的化学键是氢原子的化学键[22]，即官能团X-H(X是指O，C，N，S等)，这其中包含绝大部分类型有机物分子结构和组成信息[23]。有机物的不同使得其所含基团不同，不同基团导致能级不同，基团在不同物理化学环境中对近红外光的吸收波长都有显著差别，且吸收系数小、发热小[18]。因此，NIRS可作为获取物质理化信息的一种有效载体，通过利用NIRS方法分析分子的结构、组成，并结合化学计量方法能够达到鉴别物质结构和含量的目的。

化学计量方法的发展促进了近红外光谱技术在检测工作中的应用逐渐成熟，操作者可以从冗余光谱数据中提取有效信息，进行简化利用[24]。一是采取归一化、平滑、标准正态变换、多元散射矫正、导数光谱和均值中心化等方法对原始光谱进行预处理；二是通过主成分回归、偏最小二乘回归、非线性偏最小二乘回归等算法建立待测样品近红外光谱测量值与其目标组分之间的联系（建模）；三是用已经建立的模型对待测物（已知参考数据）进行预测，通过预测结果与参考数据进行比较对模型进行校正、评估、优化[25-27]。

近红外光谱技术分析方法的流程一般为：（1）收集并挑选有代表性的样品，尽量包含待测样品目标组分参考值数据的最大范围，并尽可能满足呈均匀分布或者呈正态分布要求；（2）采用国家或国际认可的标准理化分析方法，准确测定所收集的有代表性样品组分含量；（3）选择合适的分析条件对待测样品进行扫描并收集光谱；（4）对收集到的光谱数据进行预处理，尽可能减弱或者消除非目标因素对所采取光谱数据带来的不利影响；（5）选择合适的化学计量学方法对校正集样品经过预处理后的数据进行处理，建立校正数学模型；（6）对校正和预测模型的可靠性和预测性能进行评价[18]。

2.2 检测应用

研究表明，很多真菌毒素在近红外波段有特征吸收光谱,且其含量的高低对粮食籽粒的近红外光谱有影响[28]。近年来，已有越来越多的学者尝试将近红外光谱技术应用于粮食真菌毒素污染的快速分析[29]。

张强等[30]应用近红外光谱采集光谱信息，建立稻谷黄曲霉毒素B1支持向量回归模型，校正标准偏差和预测标准偏差分别为1.186和1.267，为准确地实施监测稻谷黄曲霉毒素B1污染提供了理论依据。Fernandez-Ibanez等[31]研究表明，通过近红外光谱法能将玉米样品的黄曲霉毒素B1检出，并按照不同浓度分为阳性（＞20 μg/kg）或阴性（＜20 μg/kg）。Sirisomboon等[32]在研究中发现，当检测水稻上的黄曲霉毒素真菌时，淀粉含量和水分均会显著影响NIR测量，从而导致较低的预测系数r2=0.68。吴启芳等[33]利用近红外光谱检测糙米中黄曲霉毒素含量，基于NIR光谱建立黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2等的线性判别分析模型，留一交互验证正确率均高于93.0%，基于NIR和MIR光谱建立黄曲霉毒素定量分析模型，偏最小二乘回归模型对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2等的预测精度和稳健性均较好，相关系数和相对分析偏差分别大于或等于0.920和2.5，但对样品中低浓度黄曲霉毒素的预测性能稍差。刘鹏等[34]开发了一种基于NIR的花生产毒霉菌污染程度的定性定量分析方法，结果显示，判别分析模型对储藏0 d、3 d、6 d、9 d花生感染谷物中常见的一种和多种霉菌的总体判别正确率分别为100%和99.17%。

Dowell和Petterson等[35-36]用近红外分析了发霉小麦中的呕吐毒素，结果表明，呕吐毒素能很好的被近红外测量和预测，其相关系数为0.984。Berardo等[37]发现近红外技术结合多变量统计分析能够预测玉米粒中真菌的总感染量，并较好地检测发霉玉米籽粒中的伏马菌素(Fumonisin B1)。Gaspardo等[38]将143个意大利玉米粉样品用于化学计量校准，并对25个未知样品进行了验证，开发的基于最小二乘回归的化学计量学模型能够鉴定总伏马毒素B1和B2含量＞4 mg/kg的样品，证明了傅立叶变化近红外光谱仪区分安全玉米粉中的污染物是可行的。

Beyer等[39]利用可见/近红外光谱技术对小麦样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行了快速分析，偏最小二乘回归模型的相关系数达到0.84，预测误差为0.89 mg/kg±3.61 mg/kg，实现了样品受污染程度的快速筛选。Kos等[40]还利用漫反射和衰减全反射红外光谱分析了玉米样品受脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染的情况，发现衰减全反射光谱对受污染样品的判别正确率达到100%，且偏最小二乘回归模型对脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的预测误差为600 μg/kg。

张晓伟等[41]采用近红外光谱技术构建红曲米中桔霉素的快速测定预测模型。采用了最小二乘回归、主成分回归、多元线性回归构建所测组分的数学模型，以相关系数、预测相对分析偏差、预测均方根误差、校正均方根误差值来评价模型的综合性能。结果表明，多元散射矫正技术、标准归一化处理方法可以消除样品颗粒不均对光谱的散射影响；导数处理能够消除基线漂移问题；对于桔霉素，3种模型的预测相对分析偏差值均小于2，虽然不能用于准确定量测定，但能满足定性分析或分级。为红曲米生产过程中桔霉素含量的快速检测提供了新方法及智能化控制新途径。

3 展望

随着近红外检测技术在硬件和软件方面的不断成熟与突破，研究者可以探索更快速、简单、准确、便携的实施操作检测方法[16]，除本文介绍的近红外光谱技术外，以高光谱图像、电子鼻为代表的无损检测技术在粮食受真菌毒素污染的检测上也取得了积极进展[17]。但是，真菌毒素的传统检测方法与无损技术都有其自身的缺点，如真菌毒素在粮食中的含量一般较低，吸收强度较弱，背景复杂，直接分离解析难以提取出足够的有用信息，需要用化学计量学方法从数据中来提取相关信息[21]，且近红外检测结果还易受到样品状态、预处理措施、样品浓度范围及样品量的影响,检测精度受到一定限制。

因此，开发更强大化学计量学方法及软件，快速、便携、专用的仪器，构建“云+网+端”的网络化平台等软硬件的研发将会促进近红外光谱技术在真菌毒素检测中的应用程度大幅度提高，有效解决粮食入库前、仓储过程中采用传统方法检测周期长等方面的突出问题，实现粮食真菌毒素污染的预警、在线检测与监控，为质量管理向“田间地头”延伸，提供更为及时、准确、全面的食品安全评价体系。