Nrf2/ARE信号通路对呼吸系统影响的研究进展

刘瑞 司少魁

解放军联勤保障部队第九八七医院呼吸内科,宝鸡721000

伴随着信息时代快速发展和人们生活压力的日益增大,呼吸系统疾病已经成为威胁人类生命健康的头号杀手。随着科研工作的不断深入,逐渐发现细胞的氧化/抗氧化失衡是引起呼吸系统疾病发病的重要机制。核因子E2 相关因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是一种细胞内广泛存在的重要转录因子,当Nrf2入核后与抗氧化反应元件 (antioxidant response element,ARE)结合,活化的ARE参与多个抗氧化酶基因及Ⅱ相解毒酶的转录与翻译[1]。经研究发现,许多呼吸系统疾病的发生与发展同Nrf2/ARE信号通路的异常密切相关,本文将对近些年Nrf2/ARE信号通路的相关研究作一综述。

1 Nrf2/ARE信号转导通路的结构组成

Nrf2/ARE信号通路的核心分子主要包括Nrf2、ARE和果蝇肌动蛋白结合蛋白 (Drosophilaactin-binding protein,Kelch)样环氧氯丙烷相关蛋白1 (Kelch-like epichlorohydrin associatedprotein 1,Keap1)[2]。

1.1 Keap1的基本结构和功能 Keap1分子基因位于染色体19p13.2位点,是一种可以同胞浆肌动蛋白结合的含624个氨基酸的多肽,其中27个为半胱氨酸残基,其相对分子质量为69 000,主要参与Nrf2的活性调控。Keap1有5个主要结构域:N 末端序列;宽阔复杂区及大复合体形成序列 (broad complex,tramtrack and bric-a-brac,BTB);富含半胱氨酸的中间区域 (intervening region,IVR);富含双甘氨酸的重复序列 (double-glycine-riched region,DGR),它含有6个Kelch片段;C 末端序列[3]。其最为重要的3个结构域为BTB 区、IVR 区、DGR 区。BTB 区在进化上高度保守,主要参与Keap1二聚体化并与Nrf2的活化有关[4],该活化过程由分子Cul3介导完成,当该结构域中的C151位点发生突变,可阻碍Keap1与Cul3的结合作用,进而导致Nrf2的活化过程受阻。IVR 区与氧化剂和亲电化合物高度敏感,该区域富含25 个半胱氨酸,其中的C257、C273、C288和C297是与亲电化合物直接反应的位点。当亲电化合物对一个或者多个半胱氨酸残基进行修饰,随后可能引起Keap1 的相关区域构象改变,而引发因子Nrf2 的 释 放,故IVR 区 对Keap1 的 激 活 必 不 可 少[5]。DGR 区含有6个Kelch功能域,该区域可形成β-折叠结构,后者是与Nrf2-Neh2相结合的位点。

1.2 Nrf2的基本结构和功能 Kan于1996年首先克隆出Nrf2,它是CNC (Cap-'n'-Collar)家族的转录因子之一,其相对分子质量为66 000～68 000,起着维持细胞内稳态的作用。Nrf2 含有6 个高度保守的结构域,称为Nrf2-ECH 同源域,被命名为Neh1-Neh6[6]。

其中在Neh1 区存在有碱性亮氨酸拉链结构 (basic leucine zipper,bZIP)DNA 结合基序,bZIP可以与小Maf蛋白 (包括MafG、Maf K、Maf F)结合形成异二聚体,该异二聚体以Neh1上的核定位序列为介导,特异识别ARE上的DNA 相应序列 (GCTGAGTCA),启动目的基因的转录。在正常的生理条件下,细胞内存在的Bach1分子是一种转录阻遏物,可以与Maf蛋白形成异源二聚体,阻止Nrf2诱发基因转录效应[7]。高度保守的Neh2位于蛋白分子的N 端区域,含有ETGE 和DLG 基序2 个结合位点,它们在Nrf2与Keap1 形成异源二聚体过程中发挥重要作用,Neh2结构域中的丝氨酸残基 (Ser40)的磷酸化可以促进Nrf2的游离释放。Neh3结构域位于蛋白分子的C 端区域,它的主要功能为激活Nrf2 的转录活性。Neh4 与Neh5为存在于Neh1 和Neh2 之间的2 个激活区,它们可以与共激活因子CREB 结合蛋白结合,继而可通过CREB结合蛋白促进Nrf2对目的基因转录的激活作用。含有许多丝氨酸残基的Neh6,是非Keap1依赖的Nrf2降解的调控区域,与Nrf2的氧化还原不敏感降解效应相关[8]。

1.3 ARE的基本结构和功能 ARE 是细胞核内的一种第Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的5'-端启动序列。该分子主要含有1个API/TPA 反应元件即THE 元件和1 个类THE元件,其序列为TGAnnnGC。作为Nrf2/ARE 信号通路的重要组成部分,该分子主要参与下游的第Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的转录与翻译。此类基因主要包括NADH 苯醌氧化还原酶 (NQOI)、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽-S-转移酶、谷氨酸半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽(glutathione,GSH)及环氧化物水解酶、过氧化氢酶、乙醛基转移酶、葡萄糖转移酶等大量细胞解毒酶和抗氧化蛋白分子。

2 Nrf2/ARE信号转导通路的调节机制

2.1 生理状态下的Nrf2/ARE信号通路 在正常生理条件下,Nrf2分子位于胞质中,可以同其特异性抑制性受体Keap1相偶联。之后与肌动蛋白细胞骨架结合,将其锚定在胞浆而使其稳定地存在细胞质中。与此同时,Keap1-Nrf2二聚体同时可与泛素化连接酶结合,促进Nrf2 的泛素化以及被蛋白酶所降解,故使Nrf2在细胞质中处于结合及持续降解的非活性状态[9]。

2.2 Nrf2/ARE 信号通路的激活机制 在细胞质中的Keap1分子上的27个半胱氨酸残基可组成一个分子开关。当细胞处于氧化应激、外源性化学物质或亲电子化合物的刺激状态时,构成分子开关的半胱氨酸残基发生氧化,从而导致Keap1与Nrf2解偶联,游离的Nrf2从细胞质中转移入核。进入细胞核之后可以同包括Maf、JunD、c-Jun的bZIP蛋白形成杂化二聚体,该异源二聚体与核内的ARE结合,可以启动第Ⅱ相解毒酶和抗氧化应激蛋白基因的转录[10]。由其介导转录血红素氧合酶1 (heme oxygenase 1,HO-1)、谷胱甘肽-S-转移酶、环氧化物水解酶等细胞保护因子,可以提高细胞对氧化应激、外源性化学物质及亲电子化合物刺激的抵抗能力,使得机体免受活性物质 (如活性氧)及一些毒性物质 (如致癌物、药物代谢活化产物)的侵害,继而影响呼吸系统疾病的进展过程[11]。

3 Nrf2/ARE信号转导通路的病理生理作用

3.1 抗炎作用 当呼吸系统发生炎症反应时,炎性细胞的浸润会引起肺损伤,并参与呼吸系统疾病的肺部重构。HO-1是一种可以催化血红素降解的限速酶,其降解产物一氧化碳、游离铁、胆绿素具有抗炎作用,对于维持HO-1的抗炎保护效应发挥着重要作用。机体内外的多项研究表明,Nrf2/ARE信号通路可以诱导HO-1 基因的表达,它是Nrf2调控的经典基因之一,当使用Nrf2活化剂钴基杂化分子处理机体细胞,经过检测发现细胞内的Nrf2/HO-1的表达效率得到明显强化,其释放的一氧化碳促进了细胞的抗炎活性[12]。核转录因子κB 是一种可诱导的蛋白转录因子,它能够调控多种炎症因子 (IL-6、IL-10、TNF-α)基因的表达过程。Ruhee和Suzuki[13]的研究发现,硫磺素可以促进Nrf2/ARE通路的活化过程,后者通过抑制核转录因子κB的活性与核移位而下调炎性细胞因子和炎性介质的表达,对机体的抗炎效应起着正相关作用。Park等[14]研究显示,分子L-2-氧代硫氮杂戊环烷-4-梭酸和α硫辛酸可以通过失活PI3K/Akt和p38蛋白激酶途径从而抑制Nrf2/ARE信号通路的激活,减少参与气道重塑的各种分子表达,从而改善小鼠呼吸系统疾病的气道变应性炎症反应过程及气道重构。

3.2 抗氧化作用 氧化应激主要与机体细胞内的活性氧和活性氮过量有关,它在绝大多数慢性呼吸系统疾病的起病过程中居于首要原因,该反应过程不仅可以直接损伤呼吸系统,而且还可以加剧相应炎症和细胞凋亡的发生[15]。天然异戊烷型二萜类球菌素C 是Nrf2/ARE 信号通路的一种特异性的激活剂,学者利用天然异戊烷型二萜类球菌素C处理正常人肺上皮Beas-2B 细胞,之后利用免疫印迹分析和免疫荧光染色等技术监测发现:与对照组相比,实验细胞内的Nrf2、ARE 分子以及其目的基因NQOI和γ-GCS分子的表达都得到强化,并且细胞内的活性氧等各项氧化损伤指标水平也远低于对照组,上述研究表明Nrf2/ARE信号通路可能参与细胞抗氧化损伤的调控过程[16]。Malhotra等[17]研究发现,对于Nrf2 基因过表达的小鼠,当其受到Nrf2/ARE信号通路的小分子激活剂异硫氰酸盐处理时,可发现细胞内相关抗氧化酶GSH 浓度明显升高。与此相对,对于Nrf2 基因敲除的小鼠,则该现象并未出现。以上研究表明,Nrf2/ARE 信号通路在抗氧化应激的刺激中起着重要作用。

3.3 抗细胞凋亡 细胞凋亡作为呼吸系统疾病炎症反应过程的最终结局之一,在呼吸系统疾病的进展过程中扮演着重要的角色。许多研究证实,Nrf2/ARE 信号通路参与了细胞凋亡过程的调控。

Lian等[18]利用慢性间歇性缺氧法构建大鼠肺细胞损伤模型,之后将此类状态的细胞用白藜芦醇处理,后者通过ERK、JNK、p38等分子而激活Nrf2/ARE 信号通路,结果显示与对照组相比,实验组的细胞凋亡率明显降低。Kweon等[19]对人肺癌A549细胞使用没食子儿茶素3-没食子酸酯处理,结果发现被处理细胞的抗凋亡能力明显升高。后来对相关分子机制的研究发现,没食子儿茶素3-没食子酸酯可以通过活化Nrf2/ARE信号通路而促进细胞内HO-1基因的表达,继而促进细胞增殖并且抑制内皮细胞的凋亡过程。Sun等[20]通过向小鼠腹腔注射内毒素 (5.0 mg/kg)诱导急性肺损伤模型,随后使用盐酸戊乙奎醚和生理盐水处理实验组和对照组小鼠,实验过程中利用Western blot法和酶联免疫吸附法监测肺脏细胞内分子表达,结果表明与对照组相比,实验组小鼠细胞内Nrf2、HO-1分子的表达明显增加,并且实验组凋亡指数及TNF-α、IL-10 炎性因子含量降低。上述实验表明盐酸戊乙奎醚可以通过活化Nrf2/ARE信号通路,从而抑制肺损伤、炎症、水肿、上皮细胞和内皮细胞死亡。

4 Nrf2/ARE信号转导通路与呼吸系统疾病

4.1 Nrf2/ARE信号通路与COPD COPD 是一种渐进性加重的疾病,其特点是不完全可逆的气流限制,该病可以进行预防和治疗。虽然COPD 的具体发病机制尚不完全清楚,但是经过多年研究发现COPD 的发病机制与慢性炎症、氧化应激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡和肺上皮细胞凋亡等有关。

Nrf2/ARE信号通路在COPD 患者机体内抵抗氧化应激以及蛋白酶/抗蛋白酶失衡、减缓疾病进程等方面发挥着十分重要的作用。Boutten等[21]对等量野生型小鼠与Nrf2基因敲除小鼠进行COPD 建模,通过对2组小鼠肺组织灌洗液中氧化应激与炎症相关指标进行测量发现,基因敲除组的炎症水平明显升高,肺组织细胞凋亡率也显著增加。进一步用分子Nrf2分子处理敲除组小鼠后发现,该组小鼠的炎症反应以及肺气肿程度明显减轻。学者Fratta Pasini等[22]对33 例轻、中度COPD 患者 [平均年龄 (66.9±6.9)岁]和37例非COPD 患者进行了 (49.7±6.9)个月的随访,之后进行临床评估、血液取样试验和肺功能测定。研究结果发现,与对照组相比,COPD 患者肺组织细胞内Nrf2分子和Nrf2相关基因HO-1、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基 (GCLC)的表达明显降低,并且FEV1的百分比变化与Nrf2分子的变化具有直接相关性 (r=0.826,P<0.001),这些结果暗示Nrf2/ARE 信号通路受到抑制可能是导致COPD 发病的决定因素之一。Yu等[23]利用香烟烟雾诱导COPD 模型,之后使用异丙天冬氨酸和生理盐水分别处理实验组和对照组小鼠,实验结束后收集支气管肺泡灌洗液,检测炎症细胞因子水平和炎症细胞数。结果表明,异丙天冬氨酸不仅可以减少炎症细胞的浸润与炎性因子的产生,还能逆转香烟烟雾引起的肺组织病理损伤。进一步的分子机制研究证实,异丙天冬氨酸上调了Nrf2/ARE 信号通路的表达,抑制了机体炎症反应和氧化应激,对香烟烟雾诱导的COPD 有保护作用,这说明了Nrf2/ARE 信号通路可以作为COPD 治疗的一个关键的靶向通路。

4.2 Nrf2/ARE信号通路与支气管哮喘 支气管哮喘是一种世界范围内的常见病,它的主要特点是气道黏液分泌增加、支气管收缩可逆性降低及气道重塑等。由于该病迁延难愈,随着疾病的不断发展,不仅常常严重降低患者的生活质量,而且还给患者的家庭及社会带来沉重的负担。有研究证实,Nrf2/ARE信号通路在支气管哮喘的发生和发展中起着重要作用。

GSH 是机体内重要抗氧化酶,分为还原型和氧化型2种类型,其比值可以用于衡量机体的氧化应激水平。当比值降低时,表明还原型GSH 被消耗,机体处于氧化应激状态。Nadeem 等[24]对小鼠进行支气管哮喘建模,随后对小鼠的炎症指标进行测量发现,实验小鼠的支气管组织中嗜酸粒细胞和淋巴细胞含量明显升高,并且气道发生明显重构;此外还发现还原型/氧化型GSH 比值较正常组显著下降,Nrf2的表达量与还原型GSH 的含量呈正相关,这些数据表明支气管哮喘的小鼠模型中的氧化应激水平主要是由Nrf2/ARE信号通路所调控。Pan等[25]发现依达拉奉是一种自由基清除剂,其具有消除活性氧的能力,因此对肺损伤具有保护作用。该团队诱导出来了一种实验性哮喘小鼠模型,之后使用依达拉奉和生理盐水分别处理实验组和对照组小鼠,实验结束后计数2组小鼠支气管肺泡灌洗液中炎性细胞和炎性因子水平以及肺组织中氧化产物和抗氧化酶的含量。结果显示,与对照组相比,依达拉奉处理可显著减少哮喘模型小鼠支气管肺泡灌洗液中的炎性细胞总数与释放的炎症细胞因子水平,并且显著减轻血管周围水肿、支气管周炎症和肺泡空间的巨噬细胞浸润。为了进一步了解其分子机制,通过检测2组肺组织中相应分子蛋白表达水平,结果证实实验组Nrf2/ARE 信号通路活化状态得到明显加强,同时依达拉奉也提高了HO-1的表达水平。本研究的结果表明,活化的Nrf2/ARE 通路和HO-1可能参与了依达拉奉的抗哮喘作用。Sakurai等[26]将野生型与Nrf2基因敲除型小鼠均暴露于香烟烟雾 (哮喘高危环境)中构建哮喘模型,之后利用地塞米松和磺胺酸 (Nrf2激活剂)联合处理实验小鼠。数周之后进行检测发现,野生型小鼠经硫磺素处理后,Nrf2介导的抗氧化反应得到了较大程度的提高,并恢复了哮喘反应的类固醇敏感性,提高机体的自身防御能力;而Nrf2缺乏的小鼠未观察到硫磺素的作用,数周之后则气道更敏感,气道高反应性更加明显,更易发生咳嗽、气喘等症状。这些结果表明,香烟烟雾在哮喘气道中引起激素缺乏反应,而硫磺素通过上调Nrf2的表达和活性来恢复类固醇的敏感性。因此,Nrf2/ARE 信号通路可能成为治疗香烟烟雾相关难治性哮喘疾病的潜在分子靶点。

4.3 Nrf2/ARE信号通路与肺癌 在目前世界的诸多癌症中,肺癌的发病率与病死率均居首位,对人类的健康产生了重大威胁。随着经济的不断发展、环境的不断恶化与与人们生活压力的增大,近几十年来,我国肺癌的发病率和病死率显著提高。然而目前的治疗措施除了手术,最为重要的治疗手段就是化疗,但是耐药现象的出现严重遏制了化疗的效果。研究表明这种耐药性的产生与Nrf2/ARE 信号通路所介导的多药耐药相关蛋白1的表达上调有关[27]。

Vartanian 等[28]将 Nrf2 和 非 靶 向 sh RNA pINDUCER10慢病毒表达载体 (pCMV-VSVG、pCMVd R8.9)质粒共转染HEK293T 细胞,之后利用强力霉素作用5 d后,采用Western blot分析法敲除Keap1 基因获得野生型模型和Keap1基因敲除模型。将2种细胞模型分别移植入小鼠,经过15 d和30 d后分别处死7只小鼠监测肿瘤发现,与野生型相比,Keap1基因敲除组小鼠肺癌发病情况明显重于野生型。该过程可能与Keap1基因的缺失引起Nrf2分子无法正常锚定于细胞质中,导致Nrf2/ARE 信号通路的过度活化有关。Tao等[29]为了进一步了解其机制,分别向小鼠注射乙烯基氨基甲酸酯和CRE 腺病毒构建肺癌化学致癌模型和遗传致癌模型。并且在造模前后均使用硫磺酸 (Nrf2激活剂)处理模型小鼠和对照组小鼠,以监测Nrf2/ARE信号通路在肺癌发生中的作用。通过取小鼠肺组织进行监测显示,在小鼠致癌之前的化学致癌模型中,硫磺酸预处理后Nrf2/ARE 信号通路的活化对于致癌物引发肺癌的发生具有抑制作用,表现为肿瘤较少;然而遗传致癌模型中,Nrf2/ARE 信号通路对肺癌的发生与发展无作用。而当致癌之后,Nrf2/ARE 信号通路的活化对于2种肺癌模型中的肺组织细胞增殖与扩散均具有促进作用,这可能由于Nrf2/ARE 信号通路能够调控体内GSH、还原型辅酶、超氧化物歧化酶、HO-1 等第Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达,进而提高癌细胞的抵抗力,从而加重了癌症的病情。该研究表明在肺癌发展之前和在肺癌不同阶段,谨慎调控Nrf2/ARE信号通路将最大限度地发挥该通路的多向性抗癌作用。

5 总结与展望

近些年来,随着科研工作者的不断努力,Nrf2/ARE信号通路相关结构、功能以及调节机制的研究得以不断深入。研究发现呼吸系统疾病与Nrf2/ARE 信号通路以及其调解网络之间存在密切联系,这也更加深刻地表明了Nrf2/ARE信号通路在机体正常发育与疾病进程中的重要性。然而我们也不得不正视Nrf2/ARE 信号通路研究所面对的难题:各类生物化学分子因素如何影响Nrf2/ARE 信号通路的活性;Nrf2/ARE 信号通路在呼吸系统疾病的病程中所发挥的作用。这些疑难问题的解决对于希望经由Nrf2/ARE信号通路而治愈呼吸系统疾病患者的治疗策略至关重要。笔者相信随着每一名医学科研人员与临床工作者的不断努力,呼吸系统疾病严重影响人类身体健康的困境一定会被打破,从而能够为更多饱受病痛折磨的患者带来康复的曙光。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突