肺炎支原体CARDS毒素致病机制和应用研究进展

方云 柏长青 牛文凯 苑鑫

解放军总医院第五医学中心感染病医学部呼吸与危重症医学科,北京100071

肺炎支原体 (Mycoplasma pneumoniae,MP)是中国社区获得性肺炎的首位致病菌[1],也是引起军队、学校等聚集性群体暴发性感染常见的病原菌。MP 的致病机制目前研究仍不十分详尽,主要有黏附损伤、膜融合损伤、营养消耗、侵入性损伤、毒性损伤、炎性及免疫损伤等[2]。社区获得性呼吸窘迫综合征 (community acquired respiratory distress syndrome,CARDS)毒素是目前发现的MP唯一毒力因子,在MP的致病机制中发挥了重要作用。现就CARDS毒素作一简要综述,以期深入理解临床MP感染。

1 CARDS毒素的发现

2005年Kannan等[3]在一项研究中发现用胰蛋白酶处理MP之后,MP与宿主细胞的结合力降低了80%～90%。由此发现了MP中有一种能与人表面结合蛋白结合的蛋白MPN372,它有591个氨基酸,相对分子质量为68 000,后被命名为CARDS毒素[3-4]。

2 CARDS毒素的致病机制

2.1 分子结构特征 CARDS毒素是由17 个α螺旋和43个β链折叠成等腰三角形的结构,N 端的单ADP-核糖基转移酶结构域 (D1)和C端串联β-三叶结构域 (D2+D3)结合以形成不同于其他公认的ADP-核糖基化细菌毒素的整体结构[5]。N 末端与百日咳毒素 (博德特菌外毒素)的S1亚基有27%的相似性[4]。C 末端的D3 结构域介导了CARDS毒素与宿主细胞的结合过程[5-6]。N 末端截短会影响到C端的功能,推测N 末端在维持C端的构象上发挥重要作用[6]。Balasubramanian等[7]研究证实CARDS毒素形成了分子内二硫键,二硫键可以保护CARDS毒素的ADP-核糖基转移酶免受蛋白酶的破坏,而且缺少二硫键后不能诱导细胞空泡化的形成,说明二硫键对CARDS毒素结构和功能都具有重要意义。

2.2 作用机制

2.2.1 CARDS毒素与宿主细胞相结合 CARDS毒素主要与宿主细胞的人表面结合蛋白受体相结合,这种结合是钙离子依赖性的。因此,对钙离子有影响的因素如重金属等都可能会对CARDS毒素与人表面结合蛋白的结合以及后续发挥毒素作用产生影响[3,8-9]。CARDS 毒素除了与人表面结合蛋白受体结合外,还可以与膜联蛋白A2 受体呈浓度依赖性结合[10]。此外,不存在人表面结合蛋白和膜联蛋白A2的情况下CARDS 毒素也能与细胞相结合,推测CARDS毒素还有其他的受体[8]。

2.2.2 CARDS毒素进入宿主细胞后到达目的地 CARDS毒素进入哺乳动物细胞时首先通过受体与细胞表面相结合,然后主要以网格蛋白内吞机制为介导,以剂量和时间依赖性的方式进入宿主细胞,并且呈温度依赖性,CARDS毒素在37 ℃时内在化的效率明显高于4 ℃时,由于阻断网格蛋白内吞机制之后还会有少量的CARDS 毒素进入细胞内,可以推测CARDS 毒素可能还存在其他的途径进入宿主细胞[11-13]。

CARDS毒素进入宿主细胞后,依赖于CARDS 毒素268～272位氨基酸之间的KELED 序列逆向转运至内质网,而后发挥细胞毒性作用,并且逃脱了溶酶体的降解。KELED 序列突变后内质网中CARDS毒素含量明显比未突变的低,并且对CARDS毒素的细胞毒性有着显著影响[12]。

2.2.3 CARDS毒素的毒性特点 CARDS毒素的N 末端区域具有ADP-核糖基转移酶活性,C末端区域能诱导细胞空泡化[5-6],这是呈时间和剂量依赖性的[12,14]。Kannan等[6]通过在CARDS 毒素的编码区域内引入终止密码子,构建CARDS毒素末端截短变体,确定ADP-核糖基转移酶活性的决定性分子位于N 末端;另一方面,缺少C 末端区域未能诱导细胞空泡化,说明CARDS毒素的C 末端介导细胞空泡化。

CARDS毒素能够通过ADP-核糖基转移酶活性激活炎性小体,释放炎症因子,进而引起一系列的炎症和过敏反应[15]。Kannan和Baseman[4]的另一个实验也显示重组CARDS毒素能使中国仓鼠卵巢细胞和HeLa细胞呈现明显的细胞空泡化,最终导致细胞死亡。另外,次级内体蛋白Rab9在CARDS毒素诱导细胞空泡化的过程中也发挥了重要作用[13]。

2.2.4 CARDS毒素引起的病理生理变化 CARDS毒素能通过炎性小体NLRP3和Th2等途径释放和增加炎性因子的表达量,从而引发各种炎症和过敏反应。CARDS毒素介导的ADP核糖基化在炎性小体NLRP3的翻译后修饰和激活过程中发挥重要作用,通过激活NLRP3释放IL-1β,并且可以诱导THP-1细胞自噬[15-16];重组CARDS毒素能诱导Th2细胞因子IL-4和IL-13的表达增加30倍,Th2趋化因子CCL17和CCL22 的表达增加70～80 倍[17];CARDS毒素的表达量越高,MP 感染的小鼠和患者支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6等炎性因子的表达水平也越高[14,18]。CARDS毒素的ADP-核糖基转移酶活性能够在小鼠中引发功能性Ig E 反应,诱导CARDS毒素特异性Ig E和总血清Ig E 含量的升高,而受CARDS 毒素特异性IgE致敏的肥大细胞会释放己糖胺酶[19],直接导致一系列过敏症状的发生。这些研究表明CARDS毒素通过介导各种炎症因子和趋化因子等引发多种炎症和过敏反应,如中性粒细胞浸润性炎症、嗜酸粒细胞性炎症、淋巴细胞性炎症以及混合性炎症等[17,20-21]。

CARDS毒素引起的炎症和过敏反应会引发一系列的病理性改变。有研究显示,CARDS毒素浓度与MP感染的小鼠肺组织病理学评分呈显著正相关。在灵长类动物模型中,暴露于MP和CARDS毒素的狒狒肺部均出现相似的组织病理学变化,如呼吸道上皮完整性丧失、纤毛停滞、炎性细胞浸润、胞浆空泡化、细胞核固缩等,并会导致类似哮喘的反应[15,22],也说明CARDS毒素在MP 致病机制中起主要作用。

3 检测方法

CARDS毒素的检测方法主要分为两大类:基因检测和蛋白检测。检测CARDS毒素基因的方法主要是利用各种PCR 方法对CARDS毒素基因进行检测,如荧光定量PCR;检测CARDS毒素蛋白的方法有蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定和抗原捕获方法等。

王良玉等[23]使用荧光定量PCR 的方法检测临床样本中的CARDS毒素基因,并用MP 血清学方法作为对照,敏感度为83.56%,两者的符合率为80.85%,敏感度和符合率都比较高。

蛋白质印迹和酶联免疫吸附测定方法都是利用抗原抗体反应来进行检测;抗原捕获测定法是Kannan等[21]开发的一种定量组织样品中的CARDS 毒素蛋白水平的方法,用已知量的重组CARDS绘制标准曲线,可以量化组织样品中CARDS毒素的量,从而对MP进行定量。

CARDS毒素蛋白检测方法比较繁琐,耗时比较长,可以对CARDS毒素蛋白进行定量;而CARDS毒素基因检测方法,尤其是荧光定量PCR,快速、简单,也可以对CARDS毒素基因定量检测,但若检测样本来源于曾经感染过MP的患者,可能出现阳性结果。这2类方法各有优劣,在实际应用过程中2种方法结合使用效果可能会更好。

4 临床价值

CARDS毒素的表达水平与临床的严重程度相关。一项临床研究发现MP 感染患儿在MP 感染急性期CARDS毒素水平最高[24];另有研究证明MP感染的病情危重程度与患者血清CARDS毒素含量呈正相关[25];而难治性MP 肺炎比非难治性MP 肺炎患者的肺泡灌洗液中CARDS毒素的水平显著升高[18]。这些研究都说明通过检测CARDS毒素基因或蛋白对MP感染的诊断和评估具有相当大的价值,尤其是在感染的早期,不仅如此,CARDS毒素的浓度还可提示临床MP肺炎的病情变化。

对于MP感染引起哮喘的患者来说,检测CARDS 毒素间接提示MP的含量,能更好地指导临床哮喘患者,尤其是难治性哮喘患者的治疗[26]。研究表明,MP 与哮喘初始和急性发作[27]、持续[28]、加重[29]和恶化[30]息息相关。基于CARDS毒素的检测方法能快速准确为临床MP 感染所致疾病的诊断提供帮助。目前MP的检测方法主要有培养、血清学、分子生物学方法等。MP 培养法虽然特异性强,但由于耗时长、灵敏度低、营养要求高等缺点,很难广泛用于临床[31];目前的金标准是双份血清学样本 (发病7～10 d左右和间隔2周后)抗体滴度升高4倍以上,耗时长,临床适用于回顾性研究[31];分子生物学方法中常用的靶基因主要有16s RNA 基因、P1蛋白基因、ATP 酶操纵子以及CARDS毒素基因等,有研究显示以CARDS毒素基因为目的基因的PCR 检测灵敏度高于其他如P1蛋白基因、ATP酶操纵子等序列[12,21-22,32-33],并且通过对临床样本的检测,CARDS毒素抗原捕获测定法的灵敏度高于任何一种PCR 方法[34-35]。

5 小结与展望

CARDS毒素所致疾病的病理生理表现与MP 高度相似,为深入理解MP致病机制提供了进一步线索。并且基于CARDS毒素的检测方法更加方便快捷,有望成为临床MP感染尤其是感染早期诊断的新方法,并为难治性哮喘等慢性气道疾病提供了研究热点。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突