畜禽骨骼肌发育相关lncRNA研究进展

刘一飞

（山西农业大学动物医学学院，山西太原030032）

畜禽肌肉的生产与消费一直在国民经济中占有显著地位，研究畜禽骨骼肌的发育和调控过程对于促进畜牧业的良性发展具有重要意义。就骨骼肌的发育阶段而言，畜禽的肌肉发育大致经历以下过程：（1）由体节分化形成含有肌源性前体细胞的生皮肌节；（2）肌前体细胞增殖、分化生成成肌细胞；（3）成肌细胞进一步增殖，随后分化和融合形成肌管；（4）最后，肌管发育成熟形成肌纤维[1]。畜禽出生后，肌细胞数量已确定不再增加，而骨骼肌的生长主要是通过增加现有肌纤维的肥大而实现。因此，深入了解骨骼肌的发育调控机制已成为生命科学的研究热点，以期满足畜牧业提高畜禽肉产品质量的迫切需求。骨骼肌的生长发育受多种因素的调控，如营养、遗传和环境。在遗传学研究中，以往的研究主要关注蛋白质编码基因在骨骼肌生长发育中的作用，如Pax 3、Pax 7、MyoD、Myf 5、MyoG以及Mef 2等生肌调节因子和肌肉发育相关转录因子[2]。后来发现非编码RNA占转录组的绝大部分，且哺乳动物基因组中只有不到2%的基因编码蛋白质[3]。因此，科学家们推测如此众多非编码RNA的存在一定具备其独特生物学功能，而非冗余无用的“噪音”序列。lncRNA作为非编码RNA的研究热点，已发现其在肌细胞分化、脂肪生成、炎症反应、肿瘤发生中广泛参与机体的各项生理病理过程。目前，国内外有关畜禽骨骼肌lncRNA高通量测序和生物学功能研究正在有序开展。笔者就近年来涉及牛、猪、羊、鸡骨骼肌发育调控的lncRNA研究做出扼要综述，旨在为后续的相关基础研究提供借鉴。

1 长链非编码RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）简介

lncRNA是一类由RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ指导转录、转录本长度大于200 nt，且不编码蛋白质的RNA（不含rRNA），广泛存在于各种真核生物体内。近年来的功能基因组研究表明，lncRNA在整个转录组中占比很高，其表达丰度远远超过编码基因的转录本。哺乳动物基因组序列中有4%～9%的序列可产生lncRNA[4]。利用高通量测序技术对真核生物进行转录组研究发现，基因组上编码lncRNA的序列是编码mRNA序列的10～20倍[5]。RNA聚合酶Ⅱ转录的lncRNA具有与mRNA类似的特征，包括5′端帽子结构、启动子、可变剪切及PolyA尾，只有很短的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）或者根本没有[4-6]，而由RNA聚合酶Ⅲ转录的lncRNA则无PolyA尾[7]。由于不编码任何蛋白质，且绝大部分lncRNA一级结构在不同物种间的保守性较差，使得lncRNA在发现伊始曾一度被认为是转录“噪音”，其对应的基因组序列也被漠视为“垃圾”DNA不具有生物学功能[8]。但随着研究的深入，尤其是2012年人类基因组ENCODE项目（DNA元素百科全书项目）的实施，才逐渐揭示出lncRNA不仅不是无义序列，而能在染色体修饰（表观遗传水平）、转录调控（转录水平）和转录后调控（翻译水平）中发挥重要作用，以多种方式调控基因表达的活性分子[9-11]。此外，lncRNA的表达具有很强的依赖发育阶段、组织细胞和生理病理状态的时空特异性[12-13]。通常，lncRNA是以顺式作用方式（cis）或反式作用方式（fans）来调控基因的表达，广泛参与诸如X染色体沉默、基因组印记、细胞分化发育、细胞周期调控、剪接调控、mRNA降解、细胞自噬以及免疫炎症等生理和病理进程[14-18]。

2 牛骨骼肌发育相关的lncRNA

2.1 牛骨骼肌lncRNA高通量测序研究

牛骨骼肌相关lncRNA的研究目前集中于不同发育阶段、不同部位的高通量测序分析和特定lncRNA的生物学功能分析。BILLEREY等[19]首次运用双端RNA测序技术鉴定出了利木赞牛背最长肌中的584种lncRNA，这些lncRNA具有哺乳动物相同的特征，即与蛋白编码基因转录本相比较，具有较短的转录本和相应较短的基因长度、仅含有少量的外显子，而且表达量显著降低。LncMD1是最先被发现的参与肌生成的lncRNA之一，仅在肌肉中特异表达。其可作为竞争性内源RNA与miR-133和miR-135相互作用，调节MAML1和MEF2C的表达（MAML1和MEF2C是激活分化晚期肌细胞内增殖分化相关基因的转录因子）[20]。随后，SUN等[21]对胚胎期、幼龄期和成年期的秦川牛背最长肌进行了lncRNA测序，发现lncMD可作为竞争性内源RNA（ceRNA）通过与miR-125b结合起到分子海绵的作用，促进肌肉的分化。且lncMD水平与miR-125b的靶基因胰岛素样生长因子（IGF2）的mRNA表达呈显著正相关。为了明确不同部位骨骼肌中lncRNA的表达差异，有研究对海福特肉牛的背、肩、肋和臀4个部位的肌肉样品进行了lncRNA测序，共鉴定出7 188条lncRNA序列，同样发现这些lncRNA具有更短的ORF以及比mRNA更少的表达量[22]。同时确定了若干IncRNA的染色体定位和整体表达模式，整合分析了与肌肉发育相关的36个IncRNA、62个miRNA和12个mRNA之间的互作关系，并通过深入分析lncRNA-miRNA-mRNA的相互关系揭示了牛骨骼肌特有的IncRNA整体表达模式和肌肉发育的重要调控靶位。张晓娟等[23]分别采集3月龄胚胎、6月龄胚胎及9月龄初生和牛的背腰肌、腿臀肌、肩胛肌和肋间肌样品进行了高通量测序分析，共鉴定出212 851条新的未注释lncRNA，不同时期差异表达的9 913条，筛选出与肌肉生成相关的lncRNA 55条、候选靶标mRNA 38条。靶标mRNA分别富集在肌动蛋白细胞骨架调节、肌动蛋白结合、骨骼肌细胞分化、组织肌肉形态、细胞骨架和凋亡调控6个词条。

2.2 牛骨骼肌lncRNA的功能研究

牛骨骼肌lncRNA的功能研究较其他物种相对匮乏，但在成肌细胞增殖、分化中已取得一定进展。张俊星等[24]基于牛骨骼肌卫星细胞转录组的测序结果，选定lnc4351合成其siRNA进行表达干扰。结果表明，下调lnc4351表达可显著抑制卫星细胞增殖，诱导分化后肌肉生长相关因子MyoG和MHC蛋白水平显著上调，促进了牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化。李燕等[25]研究表明，LncRNA-133a在3月龄胎牛肌肉组织中表达量最高，6月龄胎牛次之，9月龄胎牛及成年牛肌肉组织中表达量最低，其时序表达呈下降趋势。利用构建的过表达LncRNA-133载体（pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a）和LncRNA-133a抑制物（si-LncRNA 133a）转染牛骨骼肌卫星细胞发现，成肌因子MyoD、MyoG及MHC基因mRNA的表达水平分别显著升高和下降，证实了LncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的作用。LI等[26]对90日龄和24月龄的秦川牛背最长肌进行高通量测序后，鉴定出13 580个候选lncRNA，多数在2个发育阶段呈现差异表达。选择所有下调lncRNA中表达量最高的lncMDNCR进行荧光素酶、RNA结合蛋白免疫共沉淀和Pull-down分析，结果发现，这些表达量最高的lncMDNCR通过32个潜在结合位点与miR-133a直接作用，可作为miR-133a的分子海绵抑制细胞增殖同时促进成肌细胞分化。

3 羊骨骼肌发育相关的lncRNA

3.1 羊骨骼肌lncRNA高通量测序研究

羊肉作为我国北方居民秋冬季肉产品消费的主要膳食来源，随着饲养规模的不断扩大，与羊骨骼肌相关lncRNA的研究也在逐步开展，涉及的研究领域主要包括不同发育阶段和不同品种间差异表达lncRNA的筛选。LING等[27]通过高通量测序对山羊骨骼肌发育的7个时段lncRNA的表达进行了分析。结果表明，所选择的7个发育阶段中共鉴定出15 079个lncRNA，呈现差异表达的有547个lncRNA。此外，经构建lncRNA-mRNA共表达网络分析后推测，lnc_007561、lnc_001728与lnc_011371可能在山羊骨骼肌发育中起重要调控作用。REN等[28]运用链特异性RNA测序系统对我国湖羊骨骼肌发育的3个关键时期（胚胎期、羔羊期和成年期）的lncRNA进行了筛选。共获得6 924个骨骼肌相关lncRNA，基于GO和KEGG数据的功能注释分析得出，差异表达的lncRNA显著富集于器官形态发生、骨骼肌系统发育、刺激反应以及其他与肌肉相关的词条中。此外，该研究通过构建lncRNA与差异表达靶基因的共表达网络后发现，有7个lncRNA及其靶基因在肌肉生长中发挥重要作用。CHAO等[29]通过分析杜泊羊、美利奴羊肉羊与小尾寒羊间骨骼肌lncRNA的表达差异性，共筛选到39个lncRNA。经功能注释和共表达分析得出，29个lncRNA与细胞增殖、肌肉发育及代谢、凋亡等生命过程相关。

3.2 羊骨骼肌lncRNA的功能研究

羊骨骼肌lncRNA的功能研究涉及对成肌细胞、卫星细胞分化的促进或抑制等方面。吴明明[30]对胚胎期90、120日龄绵羊背最长肌进行了高通量测序，共得到1 114个lncRNA，经定量筛选后得到1个在胚胎期绵羊骨骼肌中特异性高表达的上调lncRNA（lnc-SEMT）。通过检测不同生长期绵羊的lnc-SEMT表达水平发现，在胚胎期120日龄时，该lncRNA的表达量最高，且出生后逐渐降低，至成年后表达水平趋于平稳。此外，该研究还分别通过构建lnc-SEMT的高表达和干扰载体转染绵羊成肌细胞、显微注射培育了转lnc-SEMT绵羊。结果表明，随着分化的进行，lnc-SEMT的表达量与MyoD、MyoG的表达量呈正相关；转基因突变绵羊的lnc-SEMT表达量为野生型绵羊的3.3倍，且转基因绵羊的肌纤维横截面积显著高于野生对照组。提示lnc-SEMT分子在绵羊成肌细胞分化过程中具有促进分化的功能。睢梦华[31]基于前期的安徽白山羊骨骼肌测序数据，筛选到lnc_002783作为功能研究对象，通过干扰其表达发现，lnc_002783与miR-188-5p的表达呈负相关，在白山羊骨骼肌卫星细胞的增殖过程中分别起促进和抑制作用。由此确定lnc_002783与miR-188-5p与白山羊骨骼肌发育相关且二者存在靶向关系，并且lnc_002783对卫星细胞的分化起抑制作用。

4 猪骨骼肌发育相关的lncRNA

4.1 猪骨骼肌lncRNA高通量测序研究

猪骨骼肌发育相关的lncRNA测序主要涉及不同品种、不同发育阶段和不同生理状态方面。GAO等[32]对比了1、90和180日龄大白猪和马身猪骨骼肌lncRNA的表达谱，共鉴定出5 153个新型lncRNA，有1 407个lncRNA在2个品种中具有相同的的表达模式。为探知DNA甲基化对猪骨骼肌发育的影响，YANG等[33]通过整合肥胖型通城猪、瘦型长白猪和迷你型五指山猪的全基因组DNA甲基化、mRNA、lncRNA和miRNA谱共鉴定出10 813个lncRNA，包括UCP3、FHL1、ANK1、HDAC4、HDAC5在内的一组lncRNA和mRNA，它们对应DNA的甲基化与表达水平呈负相关变化，共有253个差异表达的甲基化基因与体型和肥胖相关。ZHAO等[34]首次对猪胎儿骨骼肌lncRNA转录本进行了系统鉴定分析，鉴定出570种含有多个外显子的基因间lncRNA，并且提出猪lncRNA倾向性地位于介导转录调控的基因附近，而不是具有发育功能的基因附近。TANG等[35]对初生、30日龄和240日龄的贵州小型猪的背最长肌和240日龄贵州小型猪9个组织中lncRNA进行了高通量测序，鉴定出10 813个lncRNA，其中9 075个为新型lncRNA。保守模式分析显示，57%的猪lncRNA与人类和小鼠具有同源性。5 455个lncRNA表现出典型的调控分子特征，具有高度的时空特异性。XING等[36]首次构建了去势和未去势淮南公猪背最长肌的转录组图谱，共鉴定出8 946种lncRNA，包含6 743个基因间lncRNA，498个反义lncRNA和1 705个内含子lncRNA。在未去势和去势组之间存在385个差异表达的lncRNA，这些差异表达lncRNA与其靶基因可能参与雌激素受体信号通路和骨骼肌发育过程。

4.2 猪骨骼肌相关lncRNA的功能研究

前期对于小鼠和人类的研究发现，lncRNA可经由与转录因子等蛋白复合物相互作用，调节免疫细胞-T细胞、树突状细胞的分化和炎症反应中相关炎症因子的表达[37-39]。为了解系统性炎症反应对猪骨骼肌中lncRNA差异表达的影响，张琳等[40]建立了断奶仔猪脂多糖（LPS）应激模型，对前期筛选出的12个骨骼肌lncRNA进行了差异比对分析。结果表明，LPS刺激极显著降低骨骼肌中lncRNA-36199.1的表达量，lncRNA-24886.1和lncRNA-33904.1的表达量亦有下降趋势。提示这些lncRNA可能在免疫细胞的分化过程中通过其差异表达起到调控免疫细胞的功能，同时lncRNA亦可通过对炎症因子表达的调控，参与对仔猪骨骼肌炎症反应的调控。目前，已鉴定出相当数量的lncRNA参与调控猪骨骼肌生长发育，但其中多数的调控功能仍有待进一步研究。谭娅等[41]于前期高通量测序中鉴定出一条新的猪骨骼肌lncRNA G1430，为探究其生物学功能，运用生信分析对其与猪肉性状进行了关联分析。结果表明，lncRNA G1430的高表达与肉质高pH、低滴水损失以及低肉色亮度相关，并且lncRNA G1430的表达与糖酵解基因-多肌醇-多磷酸磷酸酶1（MINPP1）呈显著正相关，而与醛酮还原酶家族1成员A1（A1AKR1A1）、葡萄糖激酶（GCK）呈显著负相关。提示lncRNA G1430可能靶向调节上述3种基因的表达，参与糖酵解和能量代谢过程，进而对猪肉品质产生影响。Lnc H19是较早发现的在小鼠胚胎转录本中高表达的长链非编码RNA，且H19基因无蛋白编码能力，在多个物种中其基因序列的外显子区域保守性高，很少发生突变[42]。骨骼肌卫星细胞的分化是骨骼肌发育的重要过程，为研究lnc H19对猪骨骼肌卫星细胞的肌纤维转化的作用，姚莹[43]研究了H19对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响。结果显示，H19在卫星细胞分化过程中持续高表达，且慢肌中的表达量显著高于其他组织。进一步通过siRNA干扰H19表达发现，慢肌相关蛋白表达量显著下降，而快肌相关蛋白表达量显著升高。证明H19在猪骨骼肌纤维类型转化中起调控作用。

5 鸡骨骼肌发育相关的lncRNA研究进展

5.1 鸡骨骼肌lncRNA的高通量测序研究

相较于牛、猪等哺乳动物的lncRNA研究数量，lncRNA在鸡骨骼肌发育中的研究相对较少。LI等[44]首次利用RNA-Seq技术开展了鸡肌肉发育过程中的转录组系统鉴定，共鉴定出281个新的基因间lncRNA。这些lncRNA总体上比蛋白编码基因保守程度低，但比随机非编码序列的保守性高。为探讨lncRNA在鸡肌肉发育过程中的表达特征，LI等[45]以6周龄、14周龄、22周龄和30周龄固始鸡胸肌为材料构建了12个cDNA文库，经高通量测序共鉴定出1 252个新lncRNA和1 376个注释lncRNA。在14周龄与6周龄对比组、22周龄与14周龄对比组、22周龄与6周龄对比组、30周龄与6周龄对比组、30周龄与14周龄对比组、30周龄与22周龄对比组间分别发现了53、61、50、153、117、78个差异表达lncRNA，这些lncRNA主要分布在1号染色体。在22周龄与14周龄对比组中，发现了与肌肉发育相关的GO词条，表明在14周龄到22周龄这一阶段存在与肌肉生长发育密切相关的lncRNA及其靶基因。同时，GO富集分析显示，MAPK信号通路是不同对照组中最频繁富集的通路之一，MEF2C与其靶标lncRNA（ALDBGALT0000008862，ALDBGALT0000008865和LNC_001247）可 能 经MAPK通路调控肌肉发育。该项研究首次揭示了固始鸡胸肌中lncRNA表达在不同时期的动态变化，揭示了MAPK信号通路在肌肉发育中起着至关重要的作用。与牛、猪的胚胎骨骼肌lncRNA研究范畴类似，有研究亦开展了鸡生命早期骨骼肌中差异表达lncRNA的筛选，LI等[46]对孵化期第11日、16日鸡胚和初生1日龄雏鸡的腿肌lncRNA和mRNA转录本进行了联合分析，共鉴定出129、132、45个差异表达lncRNA和1 798、3 072、1 211个差异表达的mRNA。并且在孵化期第11日与第16日鸡胚对比组和第11日鸡胚与1日龄雏鸡对比组中，通过生信分析差异表达lncRNA后，分别预测出126、200个顺式靶基因和2、3个反式靶基因，第16日鸡胚与1日龄雏鸡对比组中预测出25个顺式靶基因。进而由此构建了lncRNA-mRNA的共表达网络，为鸡骨骼肌lncRNA的功能性研究奠定了基础。

5.2 鸡骨骼肌相关lncRNA的功能研究

lncRNA能通过多种作用机制调节机体功能，由于高通量RNA-seq研究中已鉴定出较多可能参与鸡骨骼肌生长发育的lncRNA，当前的研究侧重于从分子细胞水平探讨lncRNA在鸡骨骼肌生长发育过程中的调控作用机制。lncRNA的功能性研究发现，其可通过吸附miRNA和短分子微肽达到调控骨骼肌发育相关重要基因的表达，进而影响鸡肌肉的生长发育。首先，一些lncRNA也可以通过编码微肽调节骨骼肌生长发育。例如，在鸡胸肌组织中高表达的lncRNA-Six1，可编码产生一个相对分子质量约7 260的微肽，该微肽以顺式作用方式调控Six基因表达，具有促进骨骼肌细胞增殖的生物学功能[47]。其次，lncRNAs亦可以作为竞争性内源RNAs（ceRNAs）在鸡骨骼肌生长发育中发挥作用。MA等[48]研究表明，在鸡肉中特异表达的miR-1611同时包含lncRNA-Six1和Six1的潜在结合位点，它可以与lncRNA-Six1形成内源性竞争来调节Six1的表达。过表达miR-1611可抑制鸡成肌细胞的增殖和分化。此外，miR-1611在鸡慢肌纤维中高表达，随着表达的增加由其促进快肌纤维向慢肌纤维转变。

6 展望

在人与模式动物中，lnc-MD1、Yam-1、sirt1 AS和H19是涉及肌肉发育的众多lncRNA中功能研究较多的4个，这些lncRNA都与一个或几个miRNA相互作用，影响成肌分化。但这些lncRNA在畜禽中的研究报道还相对较少。随着RNA测序技术的不断推进，愈来愈多畜禽在不同生命阶段、不同生理状态以及不同组织细胞、不同品种间的lncRNA将被陆续鉴定出来。鉴于lncRNA在物种间的不保守性以及作用方式和表达模式的多样性和复杂性，今后lncRNA的研究方向仍应以阐明特定lncRNA的生物学功能为主，尤其是与畜禽生长发育、营养代谢、繁殖育种和机体健康相关的lncRNA。同时结合不断发展的生物技术和生信分析工具完成诸如lncRNA的靶基因的预测与验证，揭示lncRNA的高级结构，筛选互作蛋白、RNA、DNA等研究工作，进一步探寻lncRNA的产生和调节机制。