冬凌草甲素提取工艺的研究进展

郝 楠，郭 杰，陶 蕾

（兰州职业技术学院，甘肃 兰州 730070）

1 冬凌草甲素构造修饰与抗癌活性

首先，是C（1）位（和）C（14）修饰。冬凌草甲素的结构修饰位点很多，对C（1）-OH与C（14）-OH修饰是常使用的修饰模式之一，最简易的C（1）-OH与C（14）-OH修饰是使用这两大位点羟基活性的差别，通过氧化或和酰氯、酸酐等化学反应完成修饰（Scheme 1）。比如冬凌草甲素直接C（14）位羟基乙酰化，得到化学物14-乙酰冬凌草甲素（2），通过C（1）位、C（14）位羟基双乙酰获得1,14-双乙酰化冬凌草甲素（3）等。

在简易修饰的前提下进行深度修饰是常规的模式，一般以两类模式呈现：首先，是通过冬凌草甲素或其派生物的C（14）羟基与含羟基的1结构通过酯键相连（Scheme 2的的路径A）；其次，是通过环形酸酐在在冬凌草甲素或其派生物的C（14）位先引进一个羧基，再通过新引进的羧基与含羟基或氨基的结构以酯键或酰胺键相连（Scheme2的路径B）。

冬凌草甲素较高级别的C（14）位修饰是在C（14）-OH以路径A的模式引进相异功能的基团与药成分，以构成糅合体，通过协同效应应用于癌症的救治中，呋咱氨氮药物是NO供体，通过巯基还原排放气态物分子NO。NO在生理诊疗方面有着多类功能，例如抗癌症、抗炎症、静脉舒张等。对类巨噬细胞U937，NO通过调节自噬与催化NF-κB-COX-2-IL-1β的模式诱导冬凌草甲素引导自噬所强化的胞葬功能。所以，将冬凌草甲素与NO供体杂糅成一类新式的抗癌化学物是可行的。鉴于这种方略，Li等以路径A模式在冬凌草甲素或其派生物C（14）位引进呋咱氮氧成分，获得化学物15a～15i、16a～16i与17a～17i。所得到的冬凌草甲素呋咱氮氧化学混合物在体外60min可以释放较高质量的NO，化合物15a～15i、16a～16i与17a～17i相较于冬凌草甲素（1）与1-氧代-冬凌草甲素（5），对四类癌症细胞（K562、Bel-7402、MGC-803、Ca Es-17）都有了较强的抗增值活性，其抗增殖活性与NO释放有关——NO释放量大，抗增殖性就越佳。当中化合物作用15 h时抗癌活性最佳，其对K562细胞IC50是1.82·mol/L，对MGC-803细胞的IC50是1.81·mol/L，对Bel-7402细胞的IC50是0.86·mol/L。

2 冬凌草作用机制问题

针对冬凌草甲素作用机制不确定的问题，还能够在C（14）位引进荧光基团制备成冬凌草甲素的荧光探针进行冬凌草甲素作用机制的研究。例如，Xu等使用模式设计制备了很多该种类化合物26a-26e、27a-27c，其中化合物作用26 d效果最好，此化合物能够被肿瘤细胞迅速摄入，通常定位在线粒体，通过该模式佐证研究细胞色素C在冬凌草甲素诱导的线粒体介导调亡中有着极大意义。

3 冬凌草提取工艺与工艺优化论述

3.1 冬凌草甲素比例测试

3.1.1 测试波长

精密称取冬凌草甲素适度溶于95%乙醇中，定量稀释为30 mg/L试液。以95%乙醇为空白做对照，于200～400 nm波长范畴内完成紫外线扫描。

结果表明，此成分在238 nm波长范畴内基本上被完全吸纳，那么挑选其作为测试波长是可行的。

3.1.2 色谱环境

Diamonsil C18色 谱 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相甲醇—水分（55∶45）；测试波长是238 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温室温；进样量20μL。在以上色谱环境中，冬凌草甲素保存用时是8.5 min，其色谱峰与邻近物质的离析度较好。

3.1.3 标准曲线描绘

称取冬凌草甲素参照物10.0 mg，用95%的乙醇定容到50 mL，摇晃均匀，可以获得200.00 mg/L参照物标液。精密量适度，用甲醇-水（55∶45）定容到10 mL，摇晃均匀，获得0.0 mg/L、20.0 mg/L、40.0 mg/L、60.0 mg/L、80.0 mg/L的标准系列应用液。以峰面积为纵坐标（Y），以标准系列应用液浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，获得回归方程Y=24 562X-32 289（R=0.999 6），在10.0～80.0 mg/L范畴内线性反应最佳。

3.1.4 提取工艺优化

冬凌草是一类资源充裕的药食两用的植被资源，是开发保健食品的理想原料，为高效使用，目前对其活性成分的提炼萃取药理学进行深入研究，并进行开发制备及加工转化商品工作。使用超高压提炼冬凌草甲素的优化统一条件是固液比达到1∶22、乙醇浓度达到75%、UHP用时4 min与UGP压力达到320 MPa，甲素提取比例是0.322%，有着极大的发展潜能。

迈入21世纪以后，国际肿瘤病学界与新药研究部门对冬凌草的抗癌功能极为重视，从全株植被分离获得二萜类化合物、一些三萜、甾体、黄酮、生物碱、挥发油、氨基酸、有机酸及其他类化学物。药理研究表明，很多成分有着抗肿瘤功能、抗氧化功能、抗菌消炎、降血糖、抗突变、免疫等功能。研究表明，冬凌草中的三萜类成分熊果酸对多类恶性肿瘤细胞有抗增殖的效果。所以提取冬凌草中的熊果酸成分，对研发新药与保健食品有着巨大的市场意义。目前对冬凌草内冬凌草甲素等二萜类化合物提取研究很多，然而关于冬凌草内熊果酸的提取研究进展较慢，袁珂使用超临界的二氧化碳技术提取冬凌草中的熊果酸，得率极高。

3.1.5 冬凌草优化提取工艺的对比

中药有效成分的传统提取模式通常使用煎煮与回流提取工艺。目前超临界流体提炼、超声场强化、微波辅助等当代分离技术也开始在中药活性成分的提炼工作中使用。与传统模式对比，使用当代分离技术的提取工艺有着生产效果好、速率快、消耗小的特征。

冬凌草有着明显的抑菌活性，是抑制食物腐蚀与病菌的优质资源。除Escherichia coli外，冬凌草乙醇提取物的抑菌圈内径都比山梨酸要大。冬凌草乙醇提取物对Staphylococcus aureus等4类常规的食物腐蚀病菌均有明显的抑制效果，有着成为天然食物防腐剂的潜能。

当前，冬凌草抑菌活性成分的提取工艺通常使用水提与醇提的传统工艺。

而用当代分离技术来提取冬凌草抑菌活性成分是在传统的乙醇回流提取冬凌草抑菌活性成分工艺的基础上以超声场进行强化，通过与乙醇回流提取与超声提取的功效进行比较，结果表明，超声辅助乙醇回流提取工艺比乙醇回流提取工艺与超声提取工艺效果更好，其抑菌圈内径增加到21.63 mm。并且，与直接用乙醇回流提取工艺相对比，超声辅助乙醇回流提取工艺的提取用时从2 h减少到30 min。使用超声辅助乙醇回流提取冬凌草抑菌活性成分是节省成本的模式，即有助于减少提取流程中的消耗，节省用时并且有助于节省溶液。

4 结语

综上所述，由于冬凌草甲素对热不稳定，可以适度使用提取迅速、温度偏低的超声提取，该模式成本偏低，试液内杂物色素很少，有助于后期纯化。并且，其影响因素通常是提取用时、提取气温、液料比等，相对容易管控，重复性强，运用柱层析融合重结晶法来纯化冬凌草甲素有着极强的可操作性。