外泌体在心血管疾病中的研究进展

张斯文 孙轶华

心血管疾病是指与心脏功能丧失相关的一组疾病，每年约有1770万人死于心血管疾病，这给人们的生命健康带来了较大的负面影响，由于不健康的生活方式和人口老龄化现象，预计心血管疾病的病死率将进一步攀升[1]。近年来，随着冠状动脉介入治疗技术和电生理技术的发展，心血管疾病的治疗取得了长足的进步，但仍存在局限性和不可满足性。因此，探索一种新型高效的治疗方式就显得极为重要。值得注意的是，外泌体作为一种重要的细胞间信息交流载体，广泛参与了心血管疾病的血管新生、心肌纤维化及免疫炎性反应等病理生理过程，可能成为临床心血管疾病治疗的新靶点[2]。本文将对外泌体形成和释放的特征及其在心血管疾病中的研究进展做一综述，以期为今后的研究和治疗提供理论基础。

一、外泌体的概述

外泌体是一种直径为30～150nm的分泌型囊泡，具有经典的脂质双层膜结构，由Johnstone于1989年在研究网织红细胞时发现。外泌体几乎可被所有类型的细胞分泌，在电子显微镜下表现为磷脂双层包裹的扁平球体，呈特征性杯状外形[3]。外泌体的形成机制比较复杂，首先，细胞膜向内出芽形成早期核内体，随后早期核内体的内体膜二次向内出芽形成晚期核内体，最后，晚期核内体与质膜融合以胞吐方式释放到细胞外的腔内囊泡即是外泌体。此过程主要由内吞体分选转运复合体(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)完成，但是当机体内ESCRT耗竭时，则可通过CD63蛋白介导的非依赖ESCRT途径完成[4]。外泌体从细胞释放后可广泛分布于血液、唾液、脑脊液、乳汁、腹腔积液、支气管灌洗液、胆汁、尿液等体液中，并通过机体循环到达全身各处[5]。

外泌体作为一种重要的细胞间信息交流的载体，其内部含有大量不同功能的蛋白质，主要包括：①四跨膜蛋白超家族(CD9、CD53、CD63)；②热休克蛋白(Hsp60、Hsp70、Hsp90)；③细胞内源性蛋白(Alix蛋白、TSG101蛋白)；④转膜蛋白及融合蛋白(GTPases、脂筏标志性蛋白、膜联蛋白)；⑤骨架蛋白(肌动蛋白、微管蛋白)；⑥脂质相关蛋白、磷脂酶。此外，外泌体中还含有多种不同类型的RNA分子，如mRNAs、circRNAs和miRNAs等，这些RNA分子可通过转运、内吞传递给相应的受体细胞，从而发挥其生物学功能[6]。研究报道，外泌体还具有稳定性、广泛性、特异性、靶向性、生物相容性、低免疫源性等特性[7]。这些特征都为其作为临床心血管疾病的治疗工具提供了潜在的可能性。

二、外泌体与糖尿病心肌病

糖尿病是一种以代谢功能障碍为表现的疾病，其并发症是目前最紧迫的健康问题之一。据报道，包括糖尿病心肌病在内的心血管并发症占糖尿病死亡人数的80%以上[8]。然而，关于糖尿病心肌病的发病机制尚不明确，这就严重限制了临床防治策略的制定。近年来，外泌体在糖尿病心肌病的研究中取得了突出的进展，有望为糖尿病心肌病的治疗提供新策略。

Mst1(mammalian sterile 20-like kinase 1)是一种参与调节细胞凋亡和自噬Hippo途径的蛋白质。Hu等[9]研究发现，将糖尿病大鼠心肌微血管内皮细胞提取的外泌体Mst1注入心肌细胞后，心肌细胞凋亡数目增加、自噬水平减低，胰岛素抵抗水平加重。然而，沉默外泌体中Mst1蛋白，这种对心肌细胞损伤的作用就会消失。进一步研究证实，心肌微血管内皮细胞衍生的外泌体Mst1是通过减少心肌细胞内葡萄糖转运蛋白4和死亡结构蛋白之间的相互作用以及增加Mst1和死亡结构蛋白的结合来抑制糖尿病患者的葡萄糖摄取，从而加速了糖尿病心肌病的发生。此外，Wang等[10]的研究证实，糖尿病心肌细胞源性的外泌体miR-320可通过功能性下调心肌微血管内皮细胞的靶基因胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)、热休克蛋白20(heat shock protein 20, Hsp20)的表达来抑制心肌微血管内皮细胞的增殖、迁移和管状形成。这一研究为解释糖尿病引起的心肌血管生成障碍提供了一种新的分子机制。同一研究中还发现，敲除基因miR-320即可消除心肌细胞外泌体对糖尿病心血管生成的抑制作用，从而遏制糖尿病心肌病的进展。

通过前述研究发现，糖尿病状态下，心肌细胞、心血管内皮细胞衍生的外泌体均有促进糖尿病心肌病进展的作用，但是，当沉默糖尿病状态下心脏细胞外泌体中相关的miRNA或蛋白质后，外泌体的不利作用即会消失。基于此，临床监测外泌体内有关RNA或蛋白质等指标的数值变化以及研发低表达不利内容物的外泌体药物可能对糖尿病心肌病的诊断和治疗具有重大现实意义。但目前，外泌体对糖尿病性心肌病作用的一系列研究仍局限在动物实验，还需要更多的基础研究和临床实验去验证。

三、外泌体与心肌梗死

心肌梗死是缺血性心脏病/冠状动脉疾病的常在表现，其特点是冠状动脉血流突然中断，导致供血心肌细胞缺血缺氧性坏死。此外，心肌梗死常伴有心肌收缩力下降和心排出量减少等表现。在晚期，心肌梗死严重时也可能导致心律失常、心源性休克、心力衰竭的发生[11]。尽管原发性冠状动脉成形术及药物治疗可在一定程度上修复心肌梗死后受损的心功能，但此方面的研究仍需要进一步探索。最近，越来越多的证据表明，外泌体在心肌梗死的病理生理过程中起重要作用。一些来源于干细胞的外泌体被证明能够改善心肌梗死后的心功能，可能是通过抑制心肌炎性反应、减少心肌细胞凋亡和控制心肌纤维化发挥作用的。然而，一些外泌体也可能加重心肌梗死后的心肌损伤，并与血管损伤和心血管风险相关。

Shao等[12]研究发现，间充质干细胞衍生的外泌体(mesenchymal stem cell-derived exosome，MSC-Exo)可通过下调CD68的表达减少梗死区的炎性细胞浸润，从而改善心肌梗死后的心脏功能。为了增强其心肌保护作用，可以应用缺氧、基因编程或药物干预等对外泌体进行预处理。Pan等[13]研究证实，miR-146a修饰的脂肪间充质干细胞的外泌体可通过下调早期生长反应因子1(early growth response factor 1, EGR1)的表达来抑制IL-6、IL-1β和TNF-α的释放，进而减轻心肌局部炎性反应，改善急性心肌梗死所致的心肌损伤。在同一研究中还发现，抑制EGR1的表达可逆转心肌梗死诱导的NF-κB信号激活，从而阻止心肌细胞凋亡，减轻心肌纤维化，缩小心肌梗死面积，改善心功能。此外，Huang等[14]研究发现，将阿托伐他汀预处理的MSC-Exo应用于大鼠急性心肌梗死模型后，心肌梗死区的血管密度明显增加、心肌细胞凋亡数目大大减少，心功能得到显著恢复。相关研究人员认为，这一系列心肌的保护作用是由MSC-Exo中lncRNA H19进行调控的。鉴于干细胞源性外泌体对心肌梗死后受损心脏具有强大的修复作用，可以此为切入点进行更深入的研究，这将为临床制定高效的心肌梗死治疗方案提供新思路与方法。

近年来研究发现，缺氧条件下高分化的成年心肌细胞分泌的外泌体Hsp60对急性心肌梗死时期的心肌细胞有害。进一步研究证实，缺氧预处理的心肌细胞外泌体Hsp60是通过激活Toll样受体4(Toll-like receptor 4)来加重心肌梗死时心肌细胞凋亡水平的[15]。此外，Wang等[16]在心肌梗死小鼠模型中观察到，巨噬细胞衍生的外泌体中的miR-155表达显著上调，此种外泌体可被转移到心脏成纤维细胞内，进而抑制成纤维细胞增殖并促进心肌梗死状态下心脏炎性反应进展。对外泌体中的miR-155进行抑制或敲除是控制心肌梗死恶性进展的方法之一。值得注意的是，越来越多的研究发现，外泌体内部miRNA与心肌梗死时的疾病进展呈高度相关，因此，有人试图把血清或血浆外泌体中的miRNA作为诊断心肌梗死进展的生物学标志物。例如，在心肌梗死发生的早期阶段，循环中的多种miRNA(miR-208b、miR-499、miR-34a)明显上升，且以外泌体包裹的形式释放到外周血液循环中，尤其是miR-34a还与心肌梗死后左心室舒张末期内径密切相关，这提示miR-34a可作为心肌梗死患者心力衰竭发展的预测因子[17]。

四、外泌体和动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是一种脂质沉积引起的以慢性炎症为特征的血管壁损伤性疾病，严重威胁了人类的生命健康。近年来的研究发现，外泌体作为重要的细胞间通讯介质，在动脉粥样硬化发展及潜在治疗中发挥着重要作用。

在动脉粥样硬化的发展方面，Lu等[18]研究发现，巨噬细胞、血管平滑肌细胞和血小板衍生的外泌体可通过激活NF-κB途径向受体细胞传递炎性细胞因子及miRNAs(如miR-155、miR-223)，从而导致内皮炎症及动脉粥样硬化的进展。有趣的是，Wang等[19]研究发现，炎症刺激下，内皮细胞会分泌大量富含miR-92a-3p的外泌体，当其被转移到血管平滑肌细胞后，可通过影响细胞的增殖和迁移来进一步增强动脉粥样硬化的免疫炎症。此外，随着动脉粥样硬化炎症的进展，富含胆固醇、神经酰胺及甘油磷脂的外泌体数目也会明显增多，它能够通过促进内皮细胞凋亡来进一步的加速动脉粥样的恶性进展。

值得注意的是，越来越多的研究发现，干细胞的外泌体在动脉粥样硬化的治疗中具有潜在的修复作用。Li等[20]研究证实，MSC-Exo可通过上调miR-let7的表达来诱导M2型巨噬细胞的极化，从而逆转动脉粥样硬化的进展。MSC-Exo主要是通过miR-let7/HMGA2/NF-κB途径来发挥作用的。此外，Xing等[21]研究发现，脂肪干细胞源性的外泌体可通过抑制miR-343-5p来保护内皮细胞，进而防止动脉粥样硬化的恶性进展。

五、外泌体与心力衰竭

心力衰竭是一种复杂的异质性综合征，它是由心室充盈或血液排出障碍引起的，常伴有呼吸困难、疲劳以及肺水肿等临床症状。心力衰竭是一个重大和日益严重的公共卫生问题，导致了较高的发生率和病死率，而对抗心力衰竭的斗争正在给卫生保健系统带来前所未有的成本负担。尽管循证药理学和器械疗法得到广泛应用，但仍有50%的心力衰竭患者将在5年内死亡。心力衰竭患者可出现一系列症状，其严重程度从相对无症状到明显功能障碍[22]。心力衰竭的发病机制主要包括肾素-血管紧张素系统的激活、心脏血管生成减少、心肌纤维化等。诸多研究结果表明，外泌体可通过影响上述病理机制来参与心力衰竭的发生与发展。

1.外泌体和肾素-血管紧张素系统：肾素-血管紧张素系统是一种多肽级联系统，除了对血压和钠稳态具有经典的调节作用外，还参与了心力衰竭的疾病进展。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是该系统的主要效应激素，它即可以作为全身激素，又可以作为局部产生因子来发挥作用。最近一项研究发现，肾素-血管紧张素系统的激活时，AngⅡ的表达会显著上调，上调的AngⅡ会进一步刺激心肌成纤维细胞分泌大量富含miR-21的外泌体，此后，成纤维细胞源性的外泌体miR-21被递送到心肌细胞内，从而导致了心力衰竭的发生。另一方面，心肌成纤维细胞源性的外泌体也可通过激活丝裂原活化蛋白酶和蛋白激酶B来下调肾素、血管紧张素原的表达而促进AngⅡ的生成，这种效应也会引发心力衰竭的发生[23]。由此可知，抑制AngⅡ诱导的外泌体分泌可在一定程度上控制心力衰竭的发生。

2.外泌体与血管生成：血管生成是已有的内皮细胞形成新血管的过程，它在心肌修复中起重要作用。最近的一项研究报道,慢性心力衰竭患者外周血CD34阳性干细胞源性的外泌体miR-126和miR-130a表达显著减少，进一步的研究证实，外泌体miR-126和miR-130a能够通过下调血管生成阴性调节因子SPRED1和HOXA5来刺激血管生成[24]。与此同时，Qiao等[25]开展的研究也发现，与正常人心脏组织分离的基质细胞比较，心力衰竭患者心脏组织分离的基质细胞能够显著抑制心肌细胞增殖及体外管腔的形成。该现象的具体原因是由正常人基质细胞富含外泌体miR-21,它可通过PTEN/AKT信号通路促进细胞增殖与血管生成，而心力衰竭患者基质细胞由于低表达外泌体miR-21，从而使血管生成受到了抑制。以上研究表明，心力衰竭时的血管生成障碍与其疾病状态下衍生的外泌体中相关miRNA减少密切相关，这一发现为临床治疗心力衰竭患者的血管生成障碍提供了新思路。

3.外泌体与心肌纤维化：心肌纤维化是一种不良的心脏重塑，往往是由多种不同形式的心脏损伤(包括血流动力学)引起的，也是导致心力衰竭发展的一个重要因素。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)作为一个致心肌纤维化的主要因子，心力衰竭时它的含量会明显升高。研究证实，心力衰竭状态下，外泌体miR-425可通过结合 TGF-β1的3′非翻译区，而抑制心肌纤维化和心力衰竭的发展[26]。然而，Yang等[27]在大鼠心力衰竭模型中研究发现，心肌细胞衍生的外泌体miR-208a可通过靶向调控Dyrk2来促进心脏纤维化进展。综上所述，心力衰竭疾病状态下，心肌细胞来源的外泌体在心肌纤维化中扮演着双重角色，其具体作用效果与携带的内容物密切相关。

五、展 望

自外泌体发现以来，关于外泌体的研究层出不穷，尤其是近年来外泌体在心血管疾病领域的研究受到了广泛关注。外泌体可通过传递自身携带的内容物来干预糖尿病心肌病、心肌梗死、动脉粥样硬化、心力衰竭的发生与发展。但是，鉴于外泌体来源、产生途径以及富含内容物的多样性，其在心血管疾病中作用也各不相同。一方面，干细胞源性或其他含有有利内容物源性的外泌体可通过影响炎性反应，细胞凋亡、心肌纤维化、血管生成来发挥心脏保护作用。另一方面，疾病病灶刺激或携带有害内容物的外泌体也可通过影响相关分子机制来加重心血管疾病的进展。因此，外泌体在心血管疾病的病理生理进程中发挥着重要作用，应用得当可成为临床心血管疾病治疗的一个潜在的有力武器。尽管如此，但其在治疗方面还存在一系列挑战：①现有的提取方法难以一次性制备大量外泌体；②外泌体对心血管疾病体内治疗的安全性、生物有效性仍缺乏严格的科学验证；③关于外泌体在心血管疾病中的研究仍处在起步阶段，还有很多外泌体的功能或者作用具体机制还需要进一步探索。相信随着临床医学的进步和发展，外泌体在心血管领域一定会有更广泛的应用前景。