视网膜色素变性行精准医疗的机制及方法进展△

李雨雨 李如意 李根林

原发性视网膜色素变性(RP)是一组遗传性视网膜疾病，发病率约为1/4000。RP的临床特点主要有进行性视野缩小、夜盲、后极部或赤道部出现骨细胞样色素沉着、视盘蜡黄、视网膜电图显著异常或无波形等。其主要发生在婴儿期或青少年期，引起严重的视网膜营养不良和视力损害。由于个体在分子、生理、环境暴露和行为水平上具有细微差别和独特的特征，故个体对干预的反应有所差异。现代生物医学技术，如DNA测序、蛋白质组学、无线健康监测设备的可用性，使这种差异得以识别，在一定程度上暴露了对个性化医学的需求，即精准医疗(precision medicine)的需求[1]。基因组测序的实现及基因治疗的成熟使得RP成为一种非常适合精准医疗策略的眼部疾病。目前，关于RP实行精准医疗的分子机制及可行性分析研究较少，本文对基因测序技术对RP的分子诊断价值及其对基因型-表型相关性的意义进行综述，为阐明RP的发病机制，进而设计基因治疗的个性化方案提供依据。

1 精准医疗背景及概念

2016年1月，中国科学院宣布了中国精准医学计划(CPMI),该项目收集了4000名志愿者的基因信息,对其中一半的志愿者进行深入的数据挖掘，包括全基因组序列分析、基因组序列相关的健康状况分析、慢性病的基因因素和患者对药物反应的预测[2]。

精准医疗的重点是根据患者共同的基因、环境和生活方式因素来确定对患者有效的治疗方法[3]。精准医疗并不意味着为特定患者创造独特的药物或医疗设备，而是将个体分为不同的亚群，这些亚群对某一特定疾病的易感性、生物学特性、预后和治疗的反应性等方面有所不同[4]。这与传统的为普遍人群制定疾病治疗和预防策略，而较少考虑个体间的差异有所不同[2]。

2 RP的临床异质性

RP具有高度的临床异质性，在家族之间甚至在同一家族成员之间，RP的发病时间、进展速度、疾病的严重程度以及视网膜体征均存在差异。迄今为止，有65个基因突变被鉴定与RP有关。常染色体隐性RP(ARRP)是最具异质性的一种，有41个基因被鉴定或定位；对于常染色体显性遗传性RP(ADRP)，已知约一半的基因有疾病相关突变；与X连锁RP相关的基因相对较少，目前被鉴别的基因有2个(Retnet：https://sph.uth.edu/retnet/)。RP的高度异质性使得RP患者进行可靠和有效的临床分子诊断变得尤其具有挑战性。

3 基因测序协助RP进行分子诊断

不同的视网膜疾病有许多重叠的临床特征，使得准确的临床诊断变得困难，特别是在晚期视网膜营养不良的情况下。通过对不同人群(包括患者和对照组)进行全基因组测序、全外显子测序，以及进行基因型-表型分析可以确定突变基因是致病突变还是良性突变。通过筛选已知的RP基因和其他视网膜疾病基因，以靶基因外显子序列为基础进行全面的分子诊断，可以为临床医师提供更准确的临床诊断，从而实现更好的患者指导和更优质的疾病管理。

Yang等[5]对34个中国RP家族患者进行了一项外显子测序，结果发现，对最初被误诊为Leber先天性黑矇(LCA)的RP352家系，外显子测序证实了其为RP。在一些系谱有限的家系中，如RP110家系，很难确定遗传模式是ADRP还是ARRP。在这些情况下，分子遗传检测可以帮助确定实际的遗传方式。考虑到常染色体显性遗传50%的遗传风险，精确的分子遗传学诊断可以为更好的计划生育铺平道路。Birtel等[6]进行基因组测序的研究发现,家族系谱结合测序结果可以使大多数患者(82%～100%)获得分子诊断。

4 基因组测序分析基因型-表型的相关性

通过基因组测序确定突变基因不仅有助于分子诊断，也有助于分析基因型-表型的相关性，进而实现精准医疗。Parmeggiani等[7]对基因测序患者的基因型-表型相关分析结果表明：(1) RP2-XLRP先证者比RPGR突变患者的视锥细胞和视杆细胞功能损害更严重；(2) RPGR-XLRP患者表现出相似的表型，普遍存在视杆细胞功能丧失和轻中度视锥细胞功能丧失。研究扩大了导致XLRP的RPGR突变谱，有助于进一步提高基因型表型诊断水平。

同一个基因的不同突变形式同样会伴有不同的基因型-表型关系。Wheway等[8]的研究记录了PRPF31基因突变患者首次出现症状的年龄和诊断疾病的年龄，发现无义突变、移位或插入缺失的患者出现首次症状(通常为夜盲)的年龄最小，发病年龄中位数为8～12岁。缺失或剪切异常的患者往往在20～24岁首次出现症状。有重复、插入或错义突变的发病年龄中位数约为27岁。不同类型突变的发病年龄差异有统计学意义(单因素方差分析P=5.76×10-5)。

5 RP 精准医疗方法

5.1 基因治疗RP分子诊断的实现为基因治疗带来了无限的潜力，基因治疗是通过替换、沉默或编辑受影响的基因来纠正由基因突变引起的病理表型的一种强有力的治疗方法。不同的突变基因、遗传方式和基因大小均会影响基因治疗方式的选择。世界范围内临床试验数量的不断增加反映了基因治疗的潜力：在过去30年中完成、进行中或批准的临床试验超过2335项，自2012年以来显著增加[9]。眼有几个特点使其成为基因治疗的理想靶点：可视性和相对非侵入性，即疗效可以通过临床常规无创性检查进行评估和监测，血-视网膜屏障可减少全身性的免疫反应[10-11]。2017年12月，针对遗传性视网膜变性(IRD)的基因治疗产品首次上市。由Spark Therapeutics Inc.开发的Luxturna(Voretigene Neparvovec)被美国食品和药物管理局(FDA)批准通过向视网膜色素上皮(RPE) 细胞递送RPE65基因来治疗严重IRD、LCA[12]。

5.1.1 基因替代治疗基因替代治疗主要适用于功能丧失的ARRP，通过载体把一个正常基因导入感光细胞内，以非生理方式持续提高基因表达，以代替不正常、缺陷的基因，从而延缓或阻止光感受器细胞的凋亡。

MERTK是控制RPE细胞吞噬功能的重要信号蛋白，其丢失导致感光细胞变性。MERTK突变导致外节碎片的积累。在人类中，MERTK突变会导致ARRP和早期发病的视网膜营养不良。Ghazi等[13]的研究将人MERTK(hMERTK)包装成腺相关病毒(AAV2),黄斑下注射rAAV2-VMD2-hMERTK治疗6例MERTK相关性RP患者，所有患者均完成2年随访。结果显示，3例患者在治疗后主观和客观视力得到改善，基因治疗MERTK可以改善部分患者的临床症状。

5.1.2 基于RNA的治疗RP中某些突变基因的大小超过传统AAV载体负载，可选择基于RNA的疗法，对于显性负性的情况，使用反义寡核苷酸(AONs)可以使突变的等位基因被定位和降解，本来被阻断的正确的等位基因可以重新编码有功能的蛋白质，USH2A[14]、ABCA4[15]突变基因的前mRNA剪切被更正。siRNA和核酶用于转录后基因沉默，可以用于降解ADRP中RHO的转录[16]。

5.2 基因编辑视杆细胞决定簇Nrl的急性基因敲除被证明能将成年视杆细胞重新编程成视锥细胞，使其抵抗RP特异基因突变的影响，从而防止继发性视锥细胞丢失。

Zhu等[17]报道了一种利用CRISPR/Cas9介导的细胞重编程的基因治疗策略，通过将一种突变敏感细胞类型转换为一种突变不敏感/耐药的细胞类型，从而恢复组织结构和功能。将此策略应用于ARRP的RD10小鼠和PDE突变小鼠，发现视锥细胞增多，同时保留了视锥细胞、视杆细胞和视网膜组织，恢复了视觉功能。吴世靖[18]发现,CRISPR/Cas9系统可准确、有效地进行基因编辑。Bakondi等[19]在RHO突变的大鼠模型视网膜下单次注射 sgRNA/Cas9质粒,利用电穿孔刺激光感受器吸收质粒,进而选择性地将携带突变的等位基因删除,注射后大鼠的视功能改善。Latella等[20]对携带Pro23His(P23H)突变大鼠模型进行基因编辑治疗,使Rho蛋白表达下降。Suzuki等[21]通过CRISPR/Cas9将携带Mertk 2号外显子的载体插入到Mertk 基因1号内含子至2号外显子间，大鼠视功能提高。

以上研究说明基因编辑技术作为一种与基因和突变无关的治疗方式，在基因治疗方面有极大的潜能，可能成为未来基因治疗的主要发展方向。

5.3 光遗传学视觉恢复的光遗传策略基于一个简单的概念——在视杆细胞和视锥感光细胞死亡后，将剩余的光不敏感的视网膜神经元转化为光敏细胞，以传递视网膜的光敏感性[22]。RP有广泛的光感受器丢失，仅剩下双极细胞和视网膜神经节细胞。

微生物视紫红质能在动物模型中通过腺相关病毒(AAV)玻璃体内注射ChR2，成功地恢复视觉功能[22-25]。有研究通过对病毒载体的检测，发现在正常鼠和rd1小鼠的视网膜中，ChR2的表达稳定，且持续时间接近小鼠的整个生命周期[26]。在长达64周的观察中发现，在RCS大鼠视网膜中，ChR2的表达既不会产生可检测到的毒性反应，也不会产生免疫有害反应[27-28]。

因此，在临床应用中使用ChR2的潜力似乎相当大。在2017年Allergan收购的Retrosense Therapeutics公司赞助下，ChR2基因被转导到晚期RP患者的视网膜内神经元正在进行1/2期临床试验中[29]。

6 RP精准医疗的挑战及前景

精准医疗在遗传性视网膜疾病中已经取得了长足的进展，但并不意味着开发合适的治疗产品是容易的，目前仍存在很多挑战。

治疗晚期光感受器变性是一个很大的挑战。基因治疗载体合成过程中可能引起新的突变，而突变可能引起有害蛋白质的合成[30]。非病毒载体对目的基因的转移效率低，病毒载体对携带基因有大小限制，且病毒载体有一定的免疫原性，其安全性仍是个问题[31]。视网膜下注射是目前基因治疗载体传递到视网膜最主要的方式，但操作本身会损害正常的视网膜结构[32]，而眶周及系统性传递方式会因血-视网膜屏障的存在降低传递效率，新的替代方案仍需进一步研究。但基于近年取得的进展，视网膜基因治疗的前景仍非常光明[33]。