幽门螺杆菌的免疫学检测技术及其主要抗原表位

景荣先,刘昆梅,徐铠琳,邢以文,薛 满,汤 锋,郭 乐*,张国林*

(1.南京医科大学附属苏州医院(苏州市立医院)药学部，苏州 215000；2.宁夏医科大学，银川 750021；3.苏州市药品检验检测研究中心，苏州 215000；4.青海大学，西宁 810001)

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是定植于胃和十二指肠的微需氧、革兰阴性螺旋弯曲菌，是慢性胃炎、消化性胃溃疡和胃癌的重要致病因子。国际癌症机构已将H.pylori定义为胃癌的Ⅰ类致癌物。在世界范围内，H.pylori的感染率超过50%，我国67%～80%的胃溃疡和95%的十二指肠溃疡是由H.pylori感染引起的[1]。临床治疗H.pylori感染性胃病主要采用多联抗生素疗法，但抗生素导致的H.pylori耐药性、治疗后复发感染和破坏肠道微生态平衡、药物毒性和不良反应等局限性使其应用受到较大限制。基于多种抗原(或抗体)的组合表位同时具备了高灵敏度和高特异性的优点，其在H.pylori诊断和疫苗及抗体等生物技术药物开发方面具有广阔的前景。

H.pylori感染的检测可基于胃黏膜活检组织、呼气标本、胃液、血清、尿液及粪便等多种标本进行。快速尿素酶试验(RUT)检测H.pylori感染需要取胃窦和胃体等胃部组织，受试剂pH值、取材部位、组织大小、细菌量和环境温度等因素影响较大；胃组织学检测因不同染色方法而呈现的检测结果存在较大的差异性；培养法检测H.pylori感染，操作复杂、耗时，且标本转送培养需专门的转送液并保持低温；尿素呼气试验(UBT)检测H.pylori，准确性高，易于操作，可反映全胃H.pylori感染状况，克服因细菌呈“灶性”分布而造成的假阴性。但UBT检测值处于临界值附近时，结果不可靠。免疫学技术的发展和菌体表面关键抗原为免疫学检测H.pylori感染奠定了基础。

1 H.pylori的免疫学检测

随着单克隆抗体制备与纯化工艺研究的不断深入，基于抗原-抗体反应的H.pylori检测技术取得了突破性进展。酶联免疫吸附(ELISA)测定法、胶体金免疫分析法、免疫印迹法和蛋白质芯片分析法等[2]都在分析H.pylori感染方面取得了较大的进步。

胶体金免疫分析法是继酶、荧光素和同位素标记后的又一免疫标记技术，且在生物医学领域得到了广泛的应用。胶体金免疫层析、免疫金渗滤法、快速免疫测试卡和金标试纸条法是H.pylori检测的主流方法。基于胶体金检测技术的H.pylori抗体(或抗原)检测也具有较高的灵敏度和特异性，适合于H.pylori感染的大规模流行病学筛查。目前已有基于胶体金技术的H.pylori诊断试剂盒产品获国家药监局批准，本课题组也在开展基于H.pylori多重关键抗体的检测试剂的开发。

ELISA测定是将特定的抗原或抗体吸附于固定相表面，加入待检测的抗体或抗原与之反应，再加入标记的二次抗原或抗体待测抗体或抗原反应，最终根据显色情况进行分析的方法。ELISA检测H.pylori抗体(或抗原)具有灵敏度高和特异性强的优点，且操作简便、检测速度快，适合于粪便、尿液、血液或唾液等样本的分析。基于ELISA测定的H.pylori检测适合于大规模的流行病学筛查。

免疫印迹法是将H.pylori中的蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至纤维素膜上后，用相应的抗体进行免疫杂交后显色来判断H.pylori的感染情况。免疫印迹法可用于H.pylori的检测，且灵敏度高，特异性强，无创，但操作相对复杂，不适合大规模的流行病学筛查。

蛋白质芯片分析法是将H.pylori抗原包被后固定于固相膜上，将待测样本在固相膜上发生抗原抗体反应实现样本的检测。蛋白质芯片检测H.pylori可实现高通量检测，适合于流行病学检测。目前已有包被空泡毒素相关蛋白A(VacA)、细胞毒素相关蛋白A(CagA)、热休克蛋白60(Hsp60)、尿素酶(Ure)和氧不敏感的 NADPH 硝基还原酶(RdxA)等抗原的H.pylori检测用芯片。

H.pylori特异性抗原或关键抗原是基于免疫反应的H.pylori检测的关键，也是H.pylori疫苗开发的基础。通常情况下，理想的抗原应具有高免疫原性、高特异性、易制备、易储存、稳定性好等特点。Ure、细胞毒素相关蛋白A/L(CagA/L)、VacA和中性粒细胞激活蛋白(NAP)是H.pylori致病性的关键表面抗原，也是目前诊断试剂和疫苗开发的基础。采用原核表达制备上述抗原具有理想抗原的特点，适合于诊断产品的开发。

2 H.pylori的毒力蛋白抗原与应用

2.1Ure Ure为含有镍离子的金属酶，是H.pylori中含量最高的蛋白，占菌体可溶性蛋白的5%～10%[3]。Ure的结构亚单位有尿素酶A(UreA)和尿素酶B(UreB)，其中UreB为Ure的活性亚基，相对分子质量较大，具有高度的序列保守性和免疫原性。基于UreB活性的RUT及UBT是临床诊断H.pylori感染的重要手段。UreB也是开发H.pylori疫苗的最佳候选抗原。

Ure是H.pylori感染诊断的重要分子基础。RUT是基于H.pylori产生的Ure可分解尿素产生NH3和CO2，而前者可使胃黏膜组织pH值升高。通过肉眼观察pH指示剂颜色的变化可判断是否有H.pylori感染。RUT试剂成本低、检测速度快、灵敏度较高，但其必须依赖胃镜检查，属于侵入性的检查手段。UBT是基于同位素标记的尿素可被H.pylori产生的Ure分解产生CO2，通过CO2中的碳同位素来判断胃部H.pylori的感染情况。UBT的同位素标记可采用13C或14C标记。UBT属于非侵入性诊断手段，但检测过程中使用的闪烁液具有一定的辐射性，不宜对儿童或孕妇进行检测。

Ure是亚单位疫苗和表位疫苗重要的分子基础。亚单位疫苗也称组分疫苗，是近年来疫苗研究领域的重点，是通过提取微生物的特殊蛋白结构，筛选出具有免疫活性的片段制成的疫苗[4]。UreB亚单位不具有Ure的全酶活性，但具有无毒性和高免疫原性，是目前研究最广泛的H.pylori疫苗抗原[5]。UreB基因在不同菌株之间具有高度的序列保守性，呈现出较高的免疫原性的稳定性。虽然从H.pylori菌体中直接分离到的UreB数量较少，但通过基因重组与原核表达制备UreB技术的成熟为特异性UreB疫苗设计和开发奠定了基础。表位疫苗是利用基因工程的手段，通过人工合成或体外表达病原体表位，并将其作为疫苗使用。UreB蛋白是由569个氨基酸构成的大分子，将整个蛋白作为疫苗抗原存在成分复杂、特异性低和免疫应答弱的局限性，而探索UreB蛋白中激发机体免疫应答的免疫保护性优势抗原表位作为抗原具有较高的价值。目前UreB蛋白的B细胞表位已经得到了深入的研究。在分析UreB亚单位免疫小鼠的模型时发现有2个确定的UreB表位具有保护性：UreB373-385和UreB317-329，且佐剂和疫苗接种途径会影响T细胞对抗原表位的反应[6]。将霍乱毒素B亚单位(CTB)、H.pylori尿素酶Ⅰ亚单位(UreI20-29，UreI98-107)和H.pyloriUreB亚单位的4个抗原片段(UreB12-23，UreB229-251，UreB327-400和UreB515-561)连接起来，构建的多表位疫苗CTB-UreI-UreB(BIB)免疫BALB/c小鼠后发现小鼠对H.pylori攻击有显著的抵抗作用，而单独用佐剂重组霍乱毒素B亚单位(rCTB)或PBS免疫小鼠均未发现保护作用，提示BIB多表位疫苗是有潜力的候选疫苗[7]。用重组Hp尿素酶B亚单位(rUreB)接种BALB/c小鼠可产生显著的抗原特异性Th1和Th17免疫应答，在免疫小鼠中发现了UreB317-329和UreB409-421 2个新的Th表位，二者可被大量CD4+T细胞识别，且可通过诱导Th1淋巴细胞介导对H.pylori的保护作用[8]。包含Ure基因的H.pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的抗原结构，具有激发BALB/c小鼠产生H.pylori特异性抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答的作用[9]。同时，口服H.pylori多价表位疫苗CTB-Hap A-UreA-UreB-CagA (CTB-HUUC)后，BABL/c小鼠体内Ure试验阳性率明显降低，对H.pylori感染的预防效果明显[10]，且口服CTB-HUUC多价表位疫苗也能有效治疗H.pylori对BABL/c小鼠的感染。但应当指出的是，不同途径、不同剂量的UreB抗原对高效价H.pyloriUreB亚单位重组蛋白免疫血清的产量和活性有重要影响[11]。

2.2细胞毒素相关蛋白 CagA/L是由CagA致病岛基因编码的亲水性外膜蛋白，相对分子质量为120～140 kDa，具有强免疫原性。CagA蛋白羧基端具有5个重复氨基酸基序(EPIYA基序)，且基于EPIYA基序，H.pylori可分为东亚型和西方型。CagA通过依赖或不依赖酪氨酸磷酸化调控细胞增殖和分化，并能够引起胃上皮细胞发生转化而诱发癌变。CagA蛋白依据蛋白大小可分为A、B、C和D型，其一方面可刺激产生生长因子诱发癌变，另一方面也可诱导细胞生长抑制剂P21活性。CagA蛋白也是H.pylori引起炎症反应的效应分子，CagA阳性(CagA+)H.pylori诱发胃癌风险是CagA阴性(CagA-)H.pylori的7.4倍。

CagA与H.pylori感染密切相关，是H.pylori感染诊断的重要标志物，且CagA+H.pylori感染是结直肠腺瘤的危险因素。H.pylori感染是结直肠腺瘤的重要致病因子，CagA+H.pylori感染可能通过促进患者血清炎症因子及胃泌素水平参与慢性胃炎患者胃黏膜一系列病理改变的发生和进展过程[12]，且CagA+H.pylori感染可通过促进患者血清炎症因子及胃泌素刺激结直肠腺瘤细胞的异常增殖、分化，进而引起结直肠腺瘤[13]。UBT联合CagA、VacA、UreA和UreB等抗体分型有助于诊断H.pylori感染[14]。运用蛋白芯片技术检测H.pylori抗体、CagA、VacA和Ure的分型有助于临床H.pylori感染的明确诊断和H.pylori的根除率[15]。同时，H.pylori的感染与患者的CagA基因表达呈显著相关性，且CagA联合VacA可提高H.pylori感染诊断的灵敏度与准确性[16-17]。

CagA蛋白是H.pylori感染的生物标志物，具有较好的免疫原性，是开发H.pylori预防性疫苗和治疗性疫苗的良好抗原[18]。用3种重组H.pylori抗原VacA、CagA和NAP组成的疫苗免疫原性强，进行肌肉免疫后可预防H.pylori感染，健康成人耐受性好[19]。治疗性疫苗接种是控制H.pylori感染的理想选择。以不同方式表达H.pyloriCagA、VacA和UreB融合蛋白的减毒沙门氏菌载体疫苗对H.pylori感染的治疗效果与融合蛋白的排列有关，且有望成为抗H.pylori的候选疫苗[20]。慢性感染H.pylori病原体会导致胃炎和胃溃疡，并使携带者更容易患胃癌[21]，而H.pylori特异性疫苗接种是一种有广泛前途的胃癌预防策略。CagA+H.pylori感染可引起小鼠CD4+T细胞反应，而黏膜或肠外接种重组CagA可显著增强CD4+T细胞反应。将CagA特异性T细胞过继转移到T细胞缺陷、H.pylori感染的受体中，足以诱导癌前免疫病理学的全面发生。用霍乱毒素佐剂的CagA+全细胞超声疫苗免疫小鼠，可使其对H.pylori相关胃癌前体病变敏感[22]。

细胞毒素相关蛋白L(CagL)为H.pyloriⅣ型分泌系统(TFSS)菌毛结构表面蛋白，属于H.pylori的伴侣蛋白，发挥连接TFSS与靶细胞的特异性黏附作用。H.pyloriCagL氨基酸多态性与消化性溃疡及胃癌的发生有关，D58位点GG、AG基因型与E59位点AA、AG基因型可增加胃癌的发病风险[23]。H.pylori重组抗原表位肽C-CagA/L能特异性识别CagA和CagL，具有预防H.pylori感染的免疫潜力[24]。基于CagL双抗体夹心ELISA抗原检测方法基本满足敏感性高、特异性强、稳定性好的特点，建立的试剂盒批内重复和批间重复性均较好，批内变异系数在1.65%～10.5%之间，批间变异系数在1.3%～9.35%之间[25]。

2.3VacA VacA为相对分子质量为88 kDa的蛋白，几乎存在于所有的H.pylori菌株中。VacA具有多种生物学活性，可诱导细胞空泡样变性和致细胞凋亡，也可通过多种信号通路发挥细胞毒作用，损伤机体。胃溃疡、萎缩性胃炎的VacA基因表达率明显高于浅表性胃炎，VacA相对表达量可作为浅表性胃炎、萎缩性胃炎的指标[26]，且H.pylori毒力基因CagA、VacA和IceA与胃十二指肠疾病的发生及恶化密切相关[27]。H.pylori空泡毒素VacA可促进胃上皮细胞NLRP3炎性小体激活[28]，且VacA基因可能与H.pylori对克拉霉素产生耐药性相关[29]。口服抗VacA-免疫球蛋白Y(IgY)对H.pylori定植有保护作用，并能诱导胃组织发生组织学改变，且VacA-IgY有望成为治疗H.pylori感染的新药候选药物[30]。

VacA是H.pylori关键抗原之一，是判定H.pylori感染和开发H.pylori疫苗的关键蛋白。H.pylori重组空泡细胞毒素(rVacA)保留天然构象表位，可作为抗H.pylori治疗的疫苗抗原：具有构象表位的rVacA抗原具有潜在的疫苗成分，可用于血清学和组织病理学分析[31]。空泡性细胞毒素A作为H.pylori分泌的主要毒素之一，能诱导胃细胞胞浆内形成“空泡”样的膜小泡。VacA具有破坏线粒体功能、刺激细胞凋亡、阻断T细胞增殖、促进调节性T细胞增殖等作用，是一种很有前途的疫苗靶点，且已被评估为疫苗抗原[32]。在利用酿酒酵母表面展示技术筛选H.pylori候选疫苗时证实VacA抗原蛋白可成功在S.cerevisiaeEBY100表面展示，小鼠经口服免疫S.cerevisiaeEBY100/p YD1-VacA后可诱导产生较高的VacA特异性抗体，提示VacA可作为H.pylori疫苗开发的潜在抗原[33]。VacA毒素在临床表现上具有很高的效价，有助于H.pylori的持续和定植，因此被认为是生产疫苗和单克隆抗体(mAb)的关键成分之一[34]。

治疗性疫苗接种是控制H.pylori感染的理想选择，而VacA是开发口服疫苗的关键蛋白之一。表达融合蛋白CVU(CagA、VacA和UreB融合蛋白)的减毒沙门氏菌口服治疗性免疫可显著降低H.pylori在胃中的定植；融合蛋白的保护作用与特异性CD4+T细胞Th1型反应、血清免疫球蛋白G(IgG)和黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)抗体反应有关，表明表达融合蛋白CVU的减毒沙门氏菌载体疫苗优于其他疫苗，有望成为抗H.pylori的候选疫苗[20]。

2.4NAP NAP位于H.pylori体内，是铁蛋白的一种，能激活中性粒细胞释放活性氧簇。有证据显示过氧化状态与胃癌的发生过程密切相关[35]。NAP蛋白是H.pylori的重要毒力因子，与H.pylori的高致病性密切相关，NAP蛋白可通过自溶释放引起中性粒细胞和单核细胞向胃黏膜浸润，导致胃黏膜验证损伤，也可通过诱导中性粒细胞释放还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶等导致大量活性氧中间产物的释放，并攻击宿主细胞DNA分子诱导突变。

NAP具有很强的免疫原性，可用于H.pylori疫苗的开发。NAP在H.pylori疫苗开发方面有巨大的潜力，载体介导的H.pyloriNAP是疫苗研制的重要候选分子[36]。具有稳定基因型和表型的鼠伤寒沙门菌是重组多价疫苗的表达载体，如伴芳香族氨基酸基因缺失的营养缺陷型突变株以及伴腺苷酸环化酶、腺苷酸环化酶(cAMP)受体蛋白和天冬氨酸β半醛脱氢酶基因缺失营养缺陷突变株等。在分析表达H.pyloriNAP的减毒沙门疫苗菌对人类H.pylori感染的小鼠模型的免疫保护作用时证实重组疫苗菌对H.pylori感染小鼠具有一定免疫预防作用，可作为多组分重组减毒沙门疫苗菌的侯选菌株之一[37]。除沙门菌外，乳酸菌也是表达中性粒细胞激活蛋白A(NapA)疫苗的潜在载体。表达H.pyloriNapA的重组乳酸乳球菌菌株为研究NapA作为疫苗抗原和免疫调节剂的应用奠定了物质基础，扩增的NapA基因构建的重组乳酸乳球菌经乳链菌肽(nisin)诱导可表达相对分子质量为19 kD的重组蛋白，该重组蛋白可被小鼠抗H.pylori血清识别，具有口服疫苗和黏膜免疫调节的应用潜力[38]。表达NAP蛋白的乳酸菌免疫小鼠后，能够刺激小鼠产生特异的IgG和免疫球蛋白A(IgA)，提示乳酸菌可作为抗原递送载体，且为基于NAP蛋白的H.pylori口服疫苗的开发奠定了一定的实验基础[39]。表面表达H.pyloriNAP蛋白的重组枯草芽孢杆菌具有较强的免疫性，免疫小鼠15 d后NAP特异性IgG升高即达高峰[40]。表位疫苗是治疗性H.pylori感染的有效疫苗。含有H.pylori各种抗原的多价亚单位疫苗优于单价亚单位疫苗。然而，多价表位疫苗在治疗性H.pylori疫苗中是否优于单价表位疫苗尚存在争议。研究显示，H.pyloriUre、NAP、热休克蛋白60(HSP60)和H.pylori黏附素a(HpaA)的多价表位疫苗能诱导抗H.pyloriUre特异性抗体，提示基于多价表位的H.pylori抗原表位和B细胞表位的多价表位疫苗可能是一种有前途的抗H.pylori感染的候选疫苗[41]。利用H.pyloriNAP的佐剂活性，可有效诱导T细胞的活化和增殖，提高树突状细胞疫苗的免疫效果[42]。

3 小结

H.pylori是危害人类健康的常见病原体。对感染H.pylori的诊断是治疗和判断预后的前提。近年来，ELISA测定法、胶体金免疫分析法、免疫印迹法和蛋白质芯片分析法等都在H.pylori感染分析方面取得了较大的进步。H.pylori特异性抗原或关键抗原是免疫反应检测H.pylori的关键，也是开发H.pylori疫苗的基础。Ure、CagA/L、VacA、NAP等是H.pylori致病性的关键表面抗原，具有高免疫原性、高特异性、易制备、易储存和稳定性好等特点，是目前H.pylori诊断试剂和疫苗开发的基础。同时检测H.pylori的多种抗原/抗体可明显提高检测的灵敏度，而针对性分析抗原/抗体关键表位可以提高检测的特异性。构建多重抗原(或抗体)表位的表达载体是实现这一目的的有效途径。本课题组通过设计多重抗原/抗体表位的表达载体开展了基于胶体金免疫技术的H.pylori诊断试剂盒开发研究，取得了较好的结果。应当指出的是，采用原核表达多重抗原/抗体蛋白的合成速率、蛋白的折叠率、肽链聚集的速率是影响诊断试剂和生物技术药物开发的关键因素，尤其是可溶性蛋白的折叠结构和免疫原性。