小型节肢动物无形态损伤提取基因组DNA的研究进展

范海页，陈慧林，朱永航，王严，王若航，赵薇，陶香林，孙恩涛

皖南医学院检验学院，安徽 芜湖 241002

近年来，DNA条形码技术发展迅速，在物种的鉴定分析、系统发育分析、遗传多样性分析等研究中应用广泛[1]。而样本DNA的提取是获取DNA条形码的关键步骤，也是进行后续相关研究的基础[2]。样本基因组DNA的提取分为取样和提取两个重要部分，依据取样方法的不同，可分为伤害性取样和无形态损伤性取样。其中，伤害性取样均匀化研磨样本，破坏了样本重要外部形态，无法进行后续标本的回收和验证[3]；而无形态损伤性取样保留了凭证标本，有效弥补了伤害性取样的不足[4]。小型节肢动物因体型微小，目前常采用伤害性取样方法，导致现有基因数据库中大多数小型节肢动物序列因缺乏相应的凭证标本，难以进行鉴定和错误修正[4]。因此，小型节肢动物无形态损伤提取基因组DNA的研究越来越受到重视。

本文概述了已报道的小型节肢动物(体长0.1～10.0 mm)的无形态损伤取样方法，对比了小型节肢动物不同DNA提取方法的优缺点，为进一步优化改进，探索出更简单、高效的无形态损伤性基因组DNA提取方法奠定基础。

1 小型节肢动物无形态损伤取样方法

无形态损伤性取样指在不破坏实验样本重要外部形态结构的情况下，采集样本微量组织，抽提样本内容物或收集样本脱落的羽毛、粪便、尿液、卵等含有遗传信息的样品[5]。已报道的小型节肢动物无形态损伤性取样方法有微量组织取样、内容物取样、粪便取样和蜕皮组织取样。

1.1微量组织取样 微量组织取样是指在保证凭证标本形态完整性的同时，选取样本微量组织备取DNA的取样方法。闫振天等[6]利用蚊附肢成功提取基因组DNA，用于分子鉴定和基因型研究。胡佳等[7]对蝇类后足1/5跗节进行研磨，成功获得基因组DNA，用于物种鉴定。

微量组织取样所需样本组织量较少，能够较好地保护样本重要外部形态结构，为后续形态学鉴定奠定了良好基础。但是，微量组织取样所提供的DNA含量较少，可能无法进行有效的分子生物学研究。此外，对于稀有物种，即使只存在小部分的形态损坏，也可能造成样本形态学信息的巨大损失[8]。

1.2内容物取样 内容物取样是指不破坏样本重要外部形态结构的前提下，仅消化样本的表皮层[9]，获取内容物备取DNA的取样方法。高艳等[4]通过改进消化液浓度，有效缩短了昆虫表皮层的消化时间，探索出一种适用于表皮薄、身体柔软的小型节肢动物(跳虫)的无形态损伤基因组DNA提取方法。单振菊等[10]利用几丁质酶溶液消化甲螨厚几丁质外壳，建立一种无损伤提取具有厚几丁质外壳的小型节肢动物基因组DNA的方法。

内容物取样仅消化表皮层，极大程度地保护了样本形态，是小型节肢动物无形态损伤取样的有效途径。但是，不同类型的小型节肢动物表皮构成不完全相同[9]，且已报道的消化方法应用于其他类群的实际效果未知[11]。因此，内容物取样方法的更广泛应用，仍需进一步验证和改进。

1.3粪便取样 粪便取样指在物种的活动区域内采集其粪便样品，备取DNA的取样方法。新鲜粪便含有肠道脱落细胞，提取DNA比较简单[3,5]，且粪便取样对实验样本不造成任何损伤，是一种具有潜在价值的取样方法[12]。Zhu等[13]成功对5种叶螨粪便的16 SrRNA基因进行深度测序，探讨其细菌群落。但是，由于粪便长期暴露于外界环境中，极易造成DNA降解，影响DNA的提取效果[12]。Lefort等[14]利用金龟子粪便进行无损伤DNA的提取，结果显示，超过88%的粪便成功提取基因组DNA，少量存放7～8天的粪便未能成功提取。同时，粪便保存方法、预处理操作、提取方法等因素也会影响DNA提取效果，并且粪便中常含大量抑制Taq酶活性的物质，可能对后续PCR扩增产生影响[15]。

目前，粪便取样更多地应用于哺乳类、爬行类、鸟类或体型较大的节肢动物。Scriven等[16]从大黄蜂粪便中成功提取到基因组DNA，应用于群体遗传学研究。相较而言，小型节肢动物因粪便样品小，获取和保存难度较大[5]，粪便取样法的广泛应用存在困难，需进一步优化拓展。

1.4蜕皮组织取样 蜕皮组织取样指采集物种蜕皮成分作为备取DNA的取样方法。蜕皮组织被气管、腺管及前、后肠内膜等部分组织附着，可从中提取DNA[17]。目前蜕皮组织更多被运用于中大型节肢动物的基因组DNA提取，例如蜜蜂[18]，在小型节肢动物的应用相对较少，例如蚊[19]、金龟子[14]。

由于小型节肢动物的体型较小，产生的蜕皮组织样本小[20]，通常难以采集。且蜕皮组织暴露时间过长可能导致DNA降解，影响DNA提取效果。此外，土壤小型节肢动物的蜕皮组织可能存在抑制PCR反应的物质，影响后续PCR扩增[21]。

2 小型节肢动物无形态损伤性DNA提取方法

小型节肢动物无形态损伤取样后，进行后续DNA提取。目前，常被报道证实的小型节肢动物无形态损伤的DNA的提取方法有Nacl-Tris-EDTA缓冲液(sodium-chloride-Tris-EDTA buffer,STE)法、Chelex-100法、CaCl2缓冲液法和试剂盒法。

2.1STE法 STE法提取DNA是通过STE裂解液和蛋白酶K的共同作用，实现基因组DNA的提取。该方法操作简便，所用试剂少且成本低廉[23]，被广泛应用于小型节肢动物的DNA提取[22-25]。许薇等[22]采取STE法提取腐食酪螨DNA，成功用于腐食酪螨的分子鉴定。近年来，有相关研究者将此法创新应用于小型节肢动物的无形态损伤提取。张利娟等[25]通过用无菌微针穿刺和STE法相结合，成功实现无形态损伤从单头蓟马中提取基因组DNA。

虽然STE法被报道广泛用于小型节肢动物基因组DNA的提取，但运用于小型节肢动物DNA的无形态损伤提取的报道却相对较少。

2.2Chelex-100法 Chelex-100法指在高温、碱性及低离子强度条件下，使细胞膜破裂、蛋白质变性，再通过离心去除Chelex颗粒及其螯合物质，实现基因组DNA的分离获取[26]。该提取方法简单、安全，且操作过程未涉及溶液转移，减少了实验污染和样本损失，适用于微量DNA的提取[6]，且作为PCR反应模板具有良好的效果[6,26]。但Chelex-100法提取到的DNA纯度不高，应用在限制性内切酶片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)这类精细程度更高的分子实验时存在局限性[26]。

近年来，多位学者研究证明，Chelex-100法是简单而有效的小型节肢动物DNA提取方法，可用于提取如棉蚜[27]、甲螨[28]、丽蚜小蜂[29]等多个物种的基因组DNA。但是，目前Chelex-100法被报道应用于小型节肢动物的无形态损伤提取DNA仍相对较少。

2.3CaCl2缓冲液法 CaCl2缓冲液法通过CaCl2裂解缓冲液和蛋白酶K的共同作用，实现基因组DNA的粗提取。近年来，CaCl2缓冲液法是节肢动物无形态损伤基因组DNA提取常用的方法之一。Gilbert等[30]利用该方法成功扩增了50年前甲虫旧样本的COⅠ和28S rDNA序列基因，且有效保留了甲虫外部形态。此后，多位学者对该方法进行改进，用于研究不同节肢动物无形态损伤性DNA提取的实验[8，31]。Suaste-Dzul等[31]在此方法的基础上进行试剂浓度的改进，并成功用于3种中小型节肢动物无形态损伤提取。

迄今，CaCl2缓冲液法被多位研究者证实适用于节肢动物的无损伤性基因组DNA提取，但研究对象多数为大中型的节肢动物，有关小型节肢动物的研究报道较少。高艳等[4]对CaCl2缓冲液法的消化液浓度及纯化方法进行改进，有效减少了实验步骤，进一步提高了DNA质量，更大程度提高了小型节肢动物DNA提取的成功率，使CaCl2缓冲液法更加适用于小型节肢动物的无损伤性DNA提取。

2.4试剂盒法 试剂盒配备了提取DNA所需的成套试剂和用品，可直接用于提取基因组DNA，操作便捷精准，排除了人为配置试剂的误差，并减少了试剂的浪费。叶琳雄等[32]在研究中用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒结合蛋白酶K对粉蚧进行基因组DNA的无形态损伤提取，获得了高质量DNA。

然而，现阶段DNA提取试剂盒种类比较多，不同试剂盒提取速度与效果也存在较大差异[3]。魏亦寒等[35]在粉蚧DNA提取方法的探究中，分别使用GenMag Bio动物细胞组织/细胞基因组磁珠法试剂盒和Gene JET Genomic DNA纯化试剂盒法对粉蚧成虫进行基因组DNA提取，获得不同处理条件下的粉蚧DNA，使用前者试剂盒提取的DNA质量均优于后者。因此，选用试剂盒法提取小型节肢动物DNA时需关注其适用性和实用性。其次，试剂盒价格普遍较高，是限制其广泛应用的重要因素。

3 总结与展望

近年来，无形态损伤性DNA提取在小型节肢动物分子生物学、分子遗传学、系统地理学、行为生态学、动物保护学等领域中的运用具有重要意义[3]。基于无形态损伤性取样所提取的基因组DNA能够成功扩增并测序，同时还保证了实验样本重要外部形态结构的完整性，为后续凭证标本的回收奠定良好基础。但目前无形态损伤取样应用于小型节肢动物时仍存在一定局限性，如体型太小致使取样困难，适用性局限，需进行实验技术的不断优化等。此外，还有一些提取动物基因组DNA的经典方法，例如酚氯仿法、SDS法、CTAB法、盐析法，能否应用于小型节肢动物的无形态损伤DNA的提取，仍需更多探索和验证。因此，小型节肢动物无形态损伤提取DNA方法的优化改进和创新，是未来无损伤提取研究的发展趋势之一。

本研究总结整理了目前常用的小型节肢动物的DNA无形态损伤取样方法，对比了小型节肢动物不同DNA提取方法的优缺点，为后续的相关研究奠定了理论基础，为更好地开发利用无形态损伤提取小型节肢动物DNA提供了有力工具。