牡蛎三倍体育种技术研究进展

贾圆圆

(平潭综合实验区农业农村发展服务中心，福建 福州 350400)

牡蛎又称生蚝、海蛎子，隶属软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Bivalvia)、珍珠目(Pterioida)、牡蛎科(Ostreidae)，其肉质鲜美、营养丰富、富含锌、牛磺酸、糖原等营养物质[1]，是一种高蛋白、低脂肪的健康海洋贝类[2]，享有“海中牛奶”之美称。研究发现，牡蛎对化学性肝损伤具有一定程度的辅助保护作用[3]。牡蛎具有生长快速、产量高、食物链短、经济效益良好等优点[4]。世界上主要的牡蛎养殖国有中国、日本、韩国、美国、法国等，其中中国牡蛎养殖年产量约占世界牡蛎年产量的80%[5]。2020年《中国渔业年鉴》统计数据显示，中国的牡蛎养殖区主要集中在山东、福建、广东、广西等省份，养殖产量约占全国总产量的90%。2019年，中国牡蛎的养殖面积为14.51×104hm2，养殖产量高达522.6×104t，占贝类海水养殖产量的三分之一还多，占海水养殖总产量的25%左右[6]。牡蛎已成为我国乃至世界重要的水产养殖贝类。

多倍体是指体内含有三套或三套以上染色体组的生物个体，在水产贝类中，与普通二倍体相比，多倍体子代具有个体大、生长快等优势。通常将体内含有三套染色体组的生物个体称为三倍体，一般认为三倍体的个体生物具有不育性。在水产生物育种生产过程中，通过人工干预的形式使生物体中的染色体组增加的技术称为多倍体育种技术，该方法已成为获得水产生物新品种的一个重要途径。以改良水产生物种质资源、改善能量收支平衡、提高水产品质量与产量的水产生物多倍体研究，近年来一直受到业界的关注[7]。

绝大多数牡蛎为雌雄异体，但也存在雌雄同体现象，外观上难以区分，需开壳后通过水滴法或镜检法进行鉴定。学者们通过研究长牡蛎、近江牡蛎等多种牡蛎染色体核型，发现绝大多数牡蛎具有两套染色体组(2n=20)即二倍体。二倍体牡蛎在产生配子的过程中，性腺的发育需要消耗体内储存的糖原为其提供能量，精卵的排放导致牡蛎软体部极度消瘦，严重影响了牡蛎的口感和出肉率。多倍体育种技术培育的三倍体牡蛎，通过改变育性使其避免了二倍体牡蛎繁殖期间品质下降的问题，且三倍体牡蛎保持了多倍体生物个体大、生长快的优点。本文综述了近年来中国牡蛎的主要养殖品种及三倍体育种的产生机理和诱导方法，为牡蛎及其他贝类的多倍体研究提供参考。

1 主要养殖品种及育种技术

1.1 主要养殖品种概况

中国的牡蛎物种资源至少拥有30种[8]，在我国海域内，主要的经济牡蛎均属于巨蛎属，而巨蛎属在中国海域定名的种或亚种有12个[9]。也有学者[10]认为巨蛎属、牡蛎科的分类尚存争议。我国牡蛎主要的养殖品种为长牡蛎(又称太平洋牡蛎，Crassostreagigas)、福建牡蛎(又称葡萄牙牡蛎，C.angulata)、香港牡蛎(C.hongkongensis)、近江牡蛎(C.ariakensis)、熊本牡蛎(C.sikamea)等[11]。

长牡蛎，左壳凹陷，右壳隆起，鳞片排列紧密，壳形呈圆形或长三角形，个体较大，原生长于西太平洋北部海域，是一种生长快、抗逆性强、肉质肥美的经济贝类，喜高盐低温环境，适合养殖于中高纬度的海域[12]。长牡蛎原产于日本、澳大利亚等国，1982年中国从日本引进该物种。北美、欧洲等地陆续引进后，长牡蛎逐渐成为世界上养殖量较大的海水贝类养殖品种。在所有的牡蛎品种中，对长牡蛎的研究最为广泛，其中在牡蛎多倍体育种研究中，已获得长牡蛎四倍体群体及全三倍体。在中国，长牡蛎主要分布于长江口以北的黄渤海水域[13]，主要养殖区分布在山东、辽宁、江苏等地，2019年养殖面积6.05×104hm2、养殖产量118.55×104t。

福建牡蛎，左壳稍微凹陷，右壳隆起，壳外侧放射性鳞褶分布明显，壳呈黄色伴有褐色条纹，壳内肌痕为深褐色[14]，个体略小于长牡蛎，是华南地区重要的养殖贝类[15]，主要分布于长江口以南海域，福建海域分布较多。其曾经一度被认为是长牡蛎[16]，王海艳等[17]通过测序发现长牡蛎和福建牡蛎属于同一物种不同亚种的关系。福建牡蛎主要养殖区分布在福建、台湾等地，是福建最主要的养殖品种[18]，2019年养殖面积3.69×104hm2、养殖产量201.26×104t。

香港牡蛎，壳圆形或椭圆形，左壳较小，壳覆鳞片，壳色青、白或褐色，肉质发白。其主要分布在福建以南的华南沿海，而在广东、广西等地分布较多，其市场价格略高于其他牡蛎品种，已成为华南地区重要的经济贝类[19]，2019年养殖面积4.34×104hm2、养殖产量179.84×106t。研究发现，香港牡蛎养殖于我国北方海区后，冬季出现大规模死亡现象，不适于北方推广养殖。香港牡蛎属高温低盐种，在热带或亚热带的河口常与近江牡蛎共存。近年来，由于淡水入海量的逐步减少，沿海养殖区的盐度略有升高，加上养殖环境的不断恶化，以致其死亡率升高。

近江牡蛎，外壳鳞片随年龄而变化，壳内白色，边缘紫色，肌痕大且位置随壳形而变化，其长势迅速、抗逆性强，属广温广盐种，在世界各地均有分布，我国南北方也均有分布。过去，因肉色不同将近江牡蛎分为“赤蚝”和“白蚝”，王海艳等[17，20-21]利用基因测序和生物比对的方法对其进行分子系统学分析，结果表明“白蚝”与香港牡蛎的基因序列相近，订名为香港牡蛎[16]；“赤蚝”订名为“近江牡蛎”，因其在日本有明海(Ariake)也有分布，但Wakiya Y[22]通过壳形特征比较将其命名为Crassostreaariakensis，因此近江牡蛎又称为有明巨牡蛎。

熊本牡蛎，为长牡蛎的姐妹种，野生群体与长牡蛎在形态上无明显差别，相较于长牡蛎，其个体较小；壳长、壳高相差不大；外壳接近圆形；左壳凹陷较深；自壳顶放射的肋脊较明显；壳色偏浅、较白。熊本牡蛎原产于日本，主要分布于日本有明海海区，中国的中部和南部海区、韩国沿海也有分布。在我国，熊本牡蛎生长区域与福建牡蛎略微重叠，野生群体主要生长于江苏以南河口与海湾。王海艳等[23]利用分子标记技术证明了野生型熊本牡蛎存在于我国海区。由于其个体较小，在日本的养殖业中未得到重视，20世纪50年代，在日本和美国进行的长牡蛎苗种贸易中，熊本牡蛎被认为是长牡蛎而引进美国。在美国，熊本牡蛎的产卵时间晚于长牡蛎和美洲牡蛎，填补了夏季牡蛎市场的空白，加上其蚝肉爽滑、口感甘甜，深受美国消费者的喜爱，成为美国重要的经济贝类之一[24]。由于牡蛎外壳形状易受环境因素影响，美国养殖的熊本牡蛎群体的外部形态不同于日本有明海海域的野生熊本牡蛎群体，美国的熊本牡蛎左壳凹陷较深，贝壳表面放射状的背脊更加明显。

1.2 育种技术研究

中国牡蛎养殖历史悠久，多种因素使牡蛎在长期养殖生产过程出现了个体变小、生长速度缓慢、生长周期变长、品质下降等现象[4]。学者们对此也进行了大量的研究和改进工作，一方面，通过建立牡蛎良(原)种场，加强其种质资源的利用和保护，在采用传统的选择育种、杂交育种及基因育种等方法对牡蛎进行遗传改良而培育出牡蛎新品种(系)等方面均取得了重要的进展，有效地推动了我国牡蛎产业的发展。如李琪等2014年培育出我国首个牡蛎新品种长牡蛎“海大1号”，之后又相继培育出“海大2号”和“海大3号”新品种；喻子牛等2015年培育出香港牡蛎“华南1号”新品种；曾志南等2017年培育出福建牡蛎“金蛎1号” 新品种；张国范等2020年培育出“海蛎1号”新品种[11]。另一方面，通过牡蛎多倍体育种技术推动产业进步。郭希明等在1995年发明了四倍体软体动物(牡蛎、扇贝、蛤、贻贝和鲍)生产方法以及通过四倍体与二倍体交配生产三倍体的方法[25]。张跃环等在2017年发明了一种香港牡蛎四倍体幼贝的制备方法，通过优选三倍体卵子、精选二倍体精子、抑制受精卵第二极体、获得四倍体幼虫、培育四倍体子代等技术环节，利用了部分三倍体卵子可以行使正常减数分裂的特性，创造了一种抑制受精卵(三倍卵子+二倍体精子)第二极体制备四倍体的育种方法[26]。李琪等在2017年发明了一种长牡蛎“海大2号”新品种四倍体的诱导方法，为长牡蛎“海大2号”新品种四倍体的扩大养殖提供了育苗基础[27]。于瑞海等在2019年发明了一种培育葡萄牙牡蛎四倍体的方法，为三倍体葡萄牙牡蛎规模化育苗打下了基础[28]。

2 牡蛎三倍体的产生机理及培育方法

2.1 牡蛎三倍体的产生机理

减数分裂是有性生殖生物在形成配子过程中出现的细胞分裂方式，减数分裂过程染色体复制一次，细胞进行连续两次的分裂，配子(精细胞和卵细胞)中的染色体组数为体细胞的一半，如普通野生二倍体牡蛎产生的精子或卵子中含有一个染色体组。正常减数分裂过程中，一个雄性生殖细胞经过减数第一次分裂形成两个次级精母细胞，细胞继续分裂，经过减数第二次分裂后，形成四个精细胞，最后发育为四个精子；一个雌性生殖细胞经过减数第一次分裂形成一个次级卵母细胞和一个第一极体(一般不继续分裂，退化)，一个次级卵母细胞经过减数第二次分裂后形成一个卵细胞和第二极体(退化)，最终发育为一个卵子。

自然界野生牡蛎多为二倍体，正常体细胞含有两个染色体组，牡蛎体内的生殖细胞——精细胞经过两次减数分裂形成含有一个染色体组的精子。牡蛎排出的成熟卵子却停留在减数第一次分裂的前期或中期，当精卵结合形成受精卵后继续完成减数第一次分裂和减数第二次分裂，排出第一极体和第二极体，这一特殊的减数分裂过程为多倍体的诱导创造了条件，通常通过抑制第一极体或第二极体的释放使极体的染色体组留在受精卵内，达到染色体组加倍的目的，继续完成减数分裂后形成多倍体。

2.2 牡蛎三倍体的培育方法

三倍体牡蛎的培育途径主要包括以下两种：一是生物杂交法，即通过四倍体牡蛎与普通二倍体牡蛎杂交产生三倍体，理论上该方法产生的子代三倍体率达100%；另一种是通过化学方法或物理方法抑制受精卵减数分裂中第一极体或者第二极体的排出，使极体内携带的染色体组留在受精卵内，从而使染色体组数量增加，形成三倍体。通过后者形成三倍体中，常采用影响第二极体的形成从而获得三倍体。李孝绪[29]研究发现，如若抑制减数第一次分裂第一极体的形成则易导致减数第二次分裂中染色体分离过程的复杂化，带有的随机性较大，可能得到四倍体、三倍体、二倍体甚至非整倍体，子代的三倍体率低且不稳定。

2.2.1 生物杂交法

生物杂交是指不同生物群体中个体间的交配，杂交使亲本的基因配合在一起，子代将亲本的特性进行结合，具有杂交优势。在理论上，通过牡蛎的四倍体与二倍体杂交产生子代三倍体率为100%，且四倍体牡蛎可通过自身繁育形成稳定的群系从而稳定获得三倍体，因此成为三倍体牡蛎产业化养殖的有效途径，该途径操作简单，三倍体率高，避免了理化方法对胚胎发育的影响，提高了胚胎孵化率及幼虫成活率，但该途径的工作难度在于如何获得牡蛎四倍体。长牡蛎通过生物杂交法成功诱导出三倍体并应有于生产中。Guo X M等[30]将长牡蛎的二倍体与四倍体进行杂交产生全三倍体子代，阙华勇等[31]、王昭萍等[32]对子代三倍体幼虫各个发育时期的倍性进行测定，表明其三倍体率为100%，除此之外，学者发现杂交产生的三倍体孵化、存活与对照组差异不明显，进一步从实验上证明理论的可行性和方法的可推行性。除此之外，张跃环等在2017年发明了一种香港牡蛎四倍体幼贝的制备方法，李琪等在2017年发明了一种长牡蛎“海大2号”新品种四倍体的诱导方法，于瑞海等在2019年发明了一种培育葡萄牙牡蛎四倍体的方法。

2.2.2 物理方法

1)温度休克法

温度休克法是指通过剧烈地改变环境温度来抑制受精卵分裂过程中微管的形成，使纺锤体无法拉动染色体组向两端移动，从而形成多倍体细胞。温度休克法具有操作简单、成本较低、无毒、无污染等优点，该方法通常包括冷休克和热休克两种方法，因种类不同其处理方法也略有差异。温度休克法中温度的选择应根据牡蛎原始生活海区的生活温度确定，温度不宜过高或过低，最适温度一般为该种的亚致死温度。于瑞海[33]对长牡蛎受精20 min后采用4～5℃冷休克方法15 min得到三倍体的诱导效果最好，得到子代三倍体率为68%，幼贝三倍体率为60.5%，实验中通过解剖的方法人工授精，由于精卵发育的不同步性，降低了受精率和孵化率，该学者同时进行了热休克的实验研究，实验中发现受精卵到2细胞和4细胞时停止发育。容寿柏等[34]对近江牡蛎卵子受精25 min后，采用35℃热休克方法处理20 min，得到64%三倍体胚胎；采用10℃冷休克方法处理20 min得到69%三倍体胚胎，实验发现当温度超过42℃，受精卵的死亡率急剧升高，该方法得出的结论解释了于瑞海研究中的实验现象。

2)静水压法

静水压法是通过液压机等静水压设备施压于牡蛎受精卵，影响分裂过程中纺锤体中微丝、微管的形成，抑制减数第二次分裂中第二极体的排出，诱导产生牡蛎三倍体。与温度休克法相比，静水压法对胚胎的伤害作用较小，但操作过程需要专门的工作仪器即液压机。Chaiton J A等[35]对太平洋牡蛎采用静水压法诱导产生子代三倍体率为57%，该方法得到的三倍体率不高。

3)电脉冲法

电脉冲休克是利用细胞融合的方法使染色体数目加倍，从而形成多倍体，1992年Cadoret J P等[36]对长牡蛎采用600 V/cm电脉冲休克，得到子代三倍体率为55%，诱导产生20%四倍体幼虫，该方法获得的三倍体率较前两种方法效率更低。

4)渗透压法

渗透压法是新提出的获得贝类三倍体的诱导方法，主要通过降低或提高海水盐度诱导三倍体的产生。目前，该方法的诱导原理尚未明确，有专家认为，其原理可能是渗透压引起受精卵能量代谢紊乱，影响纺锤体中微丝与微管的形成，从而影响极体的形成诱导产生多倍体[37]。该方法操作简易、成本较低、诱导率高，具有广阔的应用前景。于瑞海等[38]在40%～50%太平洋牡蛎受精卵出现第一极体时，采用盐度8的低盐诱导和盐度60的高盐诱导，得到子代的三倍体率为90%以上，该实验诱导率虽高，但诱导后受精卵的发育过程会受影响，实验中长牡蛎D形幼虫孵化率明显下降。王康[39]对太平洋牡蛎采用高盐诱导方法进行三倍体诱导探索，结果表明当50%受精卵出现第一极体时，用盐度65的高盐海水处理长牡蛎受精卵20 min后，得到幼虫的三倍体率最高为65.53%，作者认为，较低的诱导率可能与精卵的质量及精卵发育的同步性有关。

2.2.3 化学方法

1)细胞松弛素B法

细胞松弛素B(简称CB)是一种真菌代谢物，能够特异性地作用于微丝，抑制收缩环的收缩功能，影响分裂沟的形成，阻止细胞继续分裂，从而诱发多倍体的形成。CB对微丝的作用具有特异性和可逆性，当CB去除后，细胞内的微丝仍可以行使正常功能。CB价格昂贵，是一种毒性极强的致癌物，不易溶于水，可溶于0.1%二甲亚砜(DMSO)溶液，多倍体诱导结束后应使用DMSO洗去CB残留液。Stanley J G等[40]通过细胞松弛素B诱导产生美洲牡蛎三倍体，该方法作为牡蛎诱导三倍体的开端，为后续学者的研究提供了理论依据。Downing S L等[41]对太平洋牡蛎采用CB诱导，得到子代三倍体率为88%左右；曾志南等[42]对僧帽牡蛎受精18 min后采用1.5 mg/L CB处理15 min，得到子代三倍体率达87.5%，实验发现诱导后牡蛎孵化率和面盘幼虫成活率都比对照组要低，这可能与CB的高毒性有关；于瑞海等[43]在太平洋牡蛎出现50%第一极体时，采用CB诱导15 min，得到子代三倍体率为91.5%，实验中对比了CB、6-DMAP、咖啡因三种方法的诱导结果，从价格、毒性、诱导率、附壳率多因素综合考量，认为咖啡因是一种相对容易推广的诱导剂；林位琅[44]分别对太平洋牡蛎、僧帽牡蛎受精卵采用CB诱导，子代三倍体率分别为68.9%、87.5%，得到的孵化率偏低，认为应从CB的处理时间、浓度、操作方法等方面做进一步的研究。

2)6-二甲氨基嘌呤法

6-二甲氨基嘌呤(简称6-DMAP)是一种嘌呤类似物，作为蛋白磷酸化抑制剂，作用于特定的激酶从而破坏微管导致微管的解聚集和纺锤体的解散，达到诱导多倍体的目的。与CB法诱导多倍体相比，6-DMAP的价格相对便宜，毒性低、无致癌风险、易溶于水且具有与CB相似的高诱导率，具有广泛的应用前景。Desrosiers R R等[45]对太平洋牡蛎采用6-DMAP诱导产生牡蛎三倍体，田传远等[46-48]对太平洋牡蛎采用6-DMAP诱导作用于第一极体时，其子代三倍体率为71.3%左右；作用于第二极体时，其子代三倍体率为93.8%，采用6-DMAP诱导太平洋牡蛎过程中也出现少量四倍体个体，该学者的研究采用Allen 和 Bushek所提出的采用观察极体出现率为指标以确定处理时间的方法，不再根据精卵混合时间作为依据，通过观察第一极体的数量把握诱导时机，为生产应用提供了新思路。林琪等[49]对太平洋牡蛎受精卵采用6-DMAP处理20 min，得到子代三倍体率为81.26%，认为受精卵的成熟度及密度是影响三倍体率的重要因素。于瑞海等[50]对太平洋牡蛎采用6-DMAP诱导，产生子代三倍体率为85.6%，其在精卵的选取和受精过程做了精心的准备，从而降低了人工受精的影响。

3)咖啡因法

咖啡因对微管的作用具有特异性，可改变微管特别敏感的Ca2+浓度，当Ca2+浓度高于10-3或极低时，微管二聚体将解聚无法组装成微管结构，染色体无法分离形成多倍体。Shpigel M等[51]研究发现温度休克与咖啡因法结合使用可使诱导效果更佳，通过对太长牡蛎采用5 mmol/L咖啡因+32℃组合诱导产生子代三倍体率达71%。王菊生[52]对太平洋牡蛎采用咖啡因+34℃组合诱导产生子代三倍体率为59.4%，于瑞海等[53]对太平洋牡蛎采用咖啡因+(33±1)℃组合诱导产生子代三倍体率最高达90.5%，实验发现，随着咖啡因浓度的升高，三倍体诱导率升高，D形幼虫孵化率降低；认为2 g/L咖啡因浓度最佳。

4)聚乙二醇法

聚乙二醇是一种细胞融合剂，通过诱导细胞融合而产生多倍体。Guo X M等[54]对长牡蛎采用聚乙二醇诱导产生了30%四倍体胚胎，为三倍体诱导做了新的尝试、探索。

5)CB+紫外照射

紫外线照射能够使精子染色体失去活性，Guo X M等[54-55]对太平洋牡蛎采用紫外线照射+CB联合诱导产生牡蛎四倍体，其诱导率高达96%，紫外线的使用降低了CB的浓度从而降低了毒性所带来的影响。

6)秋水仙素

秋水仙素是一种生物碱，对微管的组装具有抑制作用，解聚已有的微管，从而抑制纺锤体的形成或者破坏形成的纺锤体[56]，达到染色体加倍的目的。该诱导剂被广泛应用于植物中，在泥蚶[57]、皱纹盘鲍[58]中已有相应的研究数据。

此外，Nocodazole作为一种微管抑制剂，普遍应用于细胞培养的同步化操作之中，Yang H P等[59]在贝类中的硬壳蛤中诱导产生了四倍体。三氯甲烷[60]和聚乙烯二醇[61]等也具有一定的抑制细胞分裂的作用，但对贝类三倍体的诱导效果不佳。

3 展望

我国已在牡蛎多倍体育种方面进行了大量的研究，取得了一定的成果，但同时也存在一些问题。在牡蛎多倍体的育种方法上，物理方法成本较低、操作相对简单但诱导效果不佳，化学方法诱导效果虽优于物理方法，但其成本高，操作复杂，部分化学诱导剂具有毒性，对牡蛎及养殖环境都有一定的影响，这两种育种方法在牡蛎养殖生产中难以普及推广。一般认为，通过四倍体与二倍体生物杂交的方法培育出三倍体是实现牡蛎产业化的根本途径，该方法稳定性好、无毒副作用，可产业化和规模化生产。但生产实践中，稳定的四倍体群体较难获得，通过三倍体牡蛎产生的较大卵子诱导四倍体是目前牡蛎四倍体育种中较为可行的方法。随着水产养殖业的发展和多倍体育种技术的应用，牡蛎多倍体育种将会有广阔的发展前景。为此建议，首先，应加强牡蛎多倍体培育机理的相关研究，增加三倍体生长、繁育、适应性的研究，提高四倍体的遗传稳定性；其次，要加强异源多倍体的研究，将传统杂交育种与多倍体育种相结合，使其子代综合多倍体优势和杂交优势，扩展多倍体诱导技术研究的领域，培育出满足人们需求的新品种，为我国牡蛎养殖业发展作出新的贡献。