核桃分心木提取物的抗氧化活性及其对油脂氧化稳定性的影响

肖敏，赵鑫丹，郝苑汝，陈凯，翟梅枝，2*

（1.西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省核桃工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100）

核桃分心木（Diaphragma juglandis Fructus，DJF），又称核桃隔膜，是胡桃科核桃属植物核桃（Juglans regia L.）果核内的木质隔膜[1]。分心木颜色呈棕色或浅棕褐色，约占核桃总质量的4%～5%，体轻且易折断，味道苦涩、食性平和，具有健脾固肾、利尿清热等功效[2]。但分心木是核桃生产的副产品，一直被视为废弃物未得到综合利用。研究表明，核桃分心木富含多种生物活性成分，包括黄酮、有机酸、酚类、生物碱、油脂、皂苷、挥发油、氨基酸、鞣质、糖类、多肽及其他微量化合物[3]。分心木中的次生代谢物质具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、降糖和抗炎等多种生物活性作用。MENG等[4]从核桃分心木中提取的多糖具有良好的抑菌活性，且抑菌活性随着多糖浓度的增加而增强。赵焕新等[5]对分心木中分离获得的单体化合物进行抗氧化活性研究，发现没食子酸、儿茶素、槲皮素等8种化合物均显示不同程度的DPPH自由基清除能力，清除能力较强的3种化合物分别为没食子酸（IC50=2.10 mg/L）、槲皮素（IC50=3.81 mg/L）和二氢槲皮素（IC50=4.82 mg/L）。李平[6]对核桃分心木水提取物进行抗肿瘤试验，得出水提物浓度在50 μg/mL～400 μg/mL时对人结肠癌细胞增殖抑制效果显著。MENG等[7]对核桃分心木多糖DJP-2进行体外和体内降血糖测定，体外试验中，DJP-2对α-淀粉酶和α-D-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值分别为1.129 mg/mL和0.588 mg/mL；体内实验中，添加50 mg/kg DJP-2的小鼠血糖明显下降。王丹[8]通过脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS） 诱导小鼠巨噬 细胞RAW264.7建立炎症反应模型，对核桃分心木中分离得到的单体化合物进行抑制细胞炎症因子一氧化氮（NO）表达，结果显示，没食子酸、槲皮素、胡桃醌等对于炎症模型NO表达具有显著的抑制作用。综上，核桃分心木具有多种生物活性，且其具有显著的抗氧化活性。

油脂是人们膳食中最重要的营养成分和能量的来源之一[9]。油脂易氧化，其自动氧化严重影响油脂的食用品质，且危及人体健康。为防止油脂自动氧化多采用添加抗氧化剂的方法，而目前食品工业中常用的合成抗氧化剂如特丁基对苯二酚（tert-butyl hydroquinone，TBHQ）、二丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）等已被证明具有一定致癌性[10]，因此，从天然产物中寻找和开发天然无毒的抗氧化剂至关重要。徐蓓蓓[11]研究核桃不同部位提取的多酚物质对核桃油酸值的影响，结果表明TBHQ抗氧化效果最好，核桃青皮多酚效果比TBHQ略差。陈向明等[12]研究山核桃果壳提取物对菜籽油的油脂稳定性，结果表明不同添加量的山核桃果壳水浸液对菜籽油均有抗氧化活性，且随着水浸提液浓度的增加，抗氧化能力逐渐增强。

近年来核桃产业发展迅猛，随着产量的增加副产品也逐年增加，因此，综合开发利用核桃副产品提高其附加值，已成为延长核桃产业链的重要途径。本文在核桃分心木乙醇提取浓度筛选及不同极性溶剂萃取物抗氧化活性研究的基础上，探讨添加不同浓度的最佳活性萃取物对菜籽油氧化稳定性的影响，以期为核桃分心木作为天然抗氧化剂资源进行深度开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃：采自西北农林科技大学核桃种质资源圃。挑选大小基本一致且无病虫害的果实，人工去青皮、去壳，获得分心木，粉碎，过60目筛，装瓶备用。食用菜籽油：市售。

2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：北京索莱宝科技有限公司；没食子酸（标准品）：张家界奥术科技有限公司；芦丁（标准品）、维生素C：上海源叶生物科技有限公司；福林酚（生物试剂）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：天津市科密欧化学试剂有限公司；2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪[2，4，6-tri（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]：合肥博美生物科技有限责任公司；无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇：成都市科隆化学品有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

数控超声波清洗器（KH-DE）：昆山禾创超声仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-1200）：上海美谱达仪器有限公司；旋转蒸发器（RE-52AA）：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 核桃分心木乙醇溶液提取物及不同极性溶剂萃取物制备

不同浓度乙醇溶液提取物制备：以不同浓度（20%、40%、60%、80%、无水乙醇）乙醇溶液提取抗氧化活性成分，料液比 1∶30（g/mL），53 ℃超声辅助提取55 min，9 000 r/min离心10 min，收集上清液，残渣重复提取两次，合并上清液，减压浓缩得到相应浓度乙醇溶液提取物。

不同极性溶剂萃取物制备：将得到的乙醇溶液提取物用少量蒸馏水溶解，依次用1.5倍体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取至萃取液基本无色，合并萃取液，减压浓缩得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余物。

1.3.2 DPPH自由基、ABTS+自由基和羟基自由基清除率测定试验

分别采用赵鑫丹等[13]、陆彩瑞[14]以及黄尚荣等[15]的DPPH自由基、ABTS+自由基和羟基自由基清除试验方法，用VC做阳性对照，自由基清除能力以IC50值表示。

1.3.3 总酚和总黄酮含量测定

总酚含量测定：参考赵鑫丹等[13]的方法测定样品总酚含量。以0.01 mg/mL～0.06 mg/mL没食子酸为标准品建立标准曲线，得到回归方程为y=10.974x+0.017 1，R2=0.999 0。

总黄酮含量测定：参考赵鑫丹等[13]的方法测定样品总黄酮含量。以0.1 mg/mL～1.0 mg/mL芦丁为标准品建立标准曲线，得到回归方程为y=0.755 6x+0.017 1，R2=0.998 6。

1.3.4 高活性萃取物对菜籽油氧化稳定性测定

参照贺娜等[16]和南海娟等[17]的油脂氧化试验方法，采用Schaal烘箱法，稍加修改。将不同浓度正丁醇萃取物按0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的添加量分别加入菜籽油中，以0.02%的VC和TBHQ作为对照，混合均匀后所有油样置于温度为（70±1）℃的烘箱中加速氧化，每隔24 h测定其过氧化值和酸值。酸值测定方法参考GB 5009.229—2016《食品安全国家标准食品中酸价的测定》；过氧化值测定方法参考GB 5009.227—2016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》。

1.4 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 25.0进行统计分析，Duncan法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 乙醇提取浓度的筛选

不同浓度乙醇溶液的提取物DPPH自由基清除率见图1，IC50值、总酚及总黄酮含量的结果见表1。

图1 不同浓度乙醇溶液提取物对DPPH自由基清除率的影响Fig.1 Effect of different concentrations of ethanol solution extracts on the scavenging rate of DPPH free radical

表1 不同浓度乙醇溶液提取物的DPPH自由基清除能力的IC50值及总酚、总黄酮测含量Table 1 IC50 of DPPH free radical scavenging ability and total phenol and total flavonoids content of alcohol extracts at different concentrations

由图1可见，核桃分心木乙醇溶液提取物对DPPH自由基的清除率随溶液浓度升高而增强。60%乙醇溶液提取物和无水乙醇提取物的DPPH自由基清除率在浓度为0.015 mg/mL时，分别为81.42%和77.42%；在浓度为0.030 mg/mL时，清除率分别为92.36%和92.61%。当浓度为0.015 mg/mL时，60%乙醇溶液提取物DPPH自由基清除率是80%乙醇溶液提取物的1.47倍，无水乙醇提取物DPPH自由基清除率是80%乙醇溶液提取物的1.40倍。当浓度为0.030 mg/mL时，60%乙醇溶液提取物和无水乙醇提取物DPPH自由基清除率均是80%乙醇溶液提取物的1.1倍。

由表1可见，不同浓度乙醇溶液提取物的DPPH自由基清除能力强弱为60%乙醇溶液提取物＞无水乙醇提取物＞20%乙醇溶液提取物＞80%乙醇溶液提取物＞40%乙醇溶液提取物，与许多研究者得出的结果相似，如冯淦熠等[18]采用60%、70%、80%的乙醇溶液提取桑叶多酚，结果显示60%乙醇溶液提取物的DPPH自由基清除率显著高于其他浓度的乙醇溶液提取物。王静等[19]比较不同浓度乙醇溶液提取物对羟基自由基、DPPH自由基以及ABTS+自由基的清除能力，结果表明，60%乙醇溶液提取物DPPH自由基清除率最高。总酚含量大小依次为20%乙醇溶液提取物＞80%乙醇溶液提取物＞60%乙醇溶液提取物＞40%乙醇溶液提取物＞无水乙醇提取物。其中20%乙醇溶液提取物总酚含量最高，为358.921 mg没食子酸/g；无水乙醇提取物总酚含量最低，为213.058 mg没食子酸/g。不同浓度乙醇溶液提取物的总黄酮含量存在差异，含量大小依次为60%乙醇溶液提取物＞无水乙醇提取物＞20%乙醇溶液提取物＞80%乙醇溶液提取物＞40%乙醇溶液提取物。其中60%乙醇溶液提取物总黄酮含量最高，达到了736.748 mg芦丁/g；40%乙醇溶液提取物总黄酮含量最低，为389.026 mg芦丁/g。本研究结果表明，60%乙醇溶液提取物DPPH自由基清除效果最好，且总黄酮含量最高。综合考虑认为60%乙醇溶液为核桃分心木抗氧化活性物质提取的适宜溶剂，且提取物中总黄酮含量的高低可以作为提取物抗氧化活性筛选的重要指标。

2.2 核桃分心木乙醇溶液提取物不同极性萃取物的抗氧化活性

2.2.1 不同极性溶剂萃取物得率及抗氧化活性

使用不同极性有机溶剂对60%乙醇溶液提取物进行萃取。不同萃取物的萃取得率、DPPH自由基清除能力及总酚、总黄酮含量见表2。

表2 不同萃取物萃取得率和DPPH自由基清除能力的IC50值及总酚、总黄酮含量测定Table 2 Extraction rate of different extracts，IC50 of DPPH free radical scavenging ability and determination of total phenols and total flavonoids

由表2可见，就核桃分心木乙醇溶液提取物不同溶剂的萃取得率来看，大小顺序依次为正丁醇萃取物＞萃余物＞乙酸乙酯萃取物＞石油醚萃取物。正丁醇萃取物得率最高，为47.360%，石油醚萃取物得率最低，仅为5.882%，正丁醇萃取物得率为石油醚萃取物得率的8倍左右。就DPPH自由基清除能力而言，正丁醇萃取物的DPPH自由基清除能力最强，其IC50值为0.010 mg/mL，乙酸乙酯萃取物次之，IC50值为0.011mg/mL，两者接近；石油醚萃取物的清除能力最弱，IC50值为1.070 mg/mL。就总酚和总黄酮含量而言，正丁醇萃取物的均为最高。各萃取物的DPPH自由基清除能力及总酚、总黄酮的含量大小顺序均为正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>萃余物>石油醚萃取物。这与甄兆孟等[20]、邵瑾等[21]研究结果一致。综合分析显示，核桃分心木乙醇溶液提取物的正丁醇萃取物中总酚及总黄酮含量最高，且DPPH自由基清除能力最好，故选择正丁醇萃取物进行核桃分心木抗氧化活性研究。

2.2.2 高活性萃取物的抗氧化活性

不同浓度正丁醇萃取物对DPPH自由基、ABTS+自由基以及羟基自由基的清除能力由其IC50值表示，VC为对照，结果如表3所示。

表3 正丁醇萃取物的抗氧化能力的IC50值Table 3 IC50 values for the antioxidant capacity of n-butanol extracts mg/mL

由表3可见，正丁醇萃取物可有效清除DPPH自由基，IC50值为0.010 mg/mL。高洁[22]对核桃隔膜抗氧化能力的研究结果显示，隔膜中的黄酮对DPPH自由基的清除能力接近VC，本研究结果与其有一定差距，这可能是正丁醇萃取物中物质种类多，多种物质共存对黄酮类物质的抗氧化能力产生了一定的拮抗作用。正丁醇萃取物对ABTS+自由基也有较强的清除能力，其IC50值为0.010 mg/mL，但对羟基自由基的清除能力较弱，IC50值为1.226 mg/mL。结合表2分析，核桃分心木乙醇溶液提取物的正丁醇萃取物中总酚和总黄酮含量高，可以有效清除DPPH自由基和ABTS+自由基。

2.2.3 高活性萃取物对菜籽油氧化稳定性的影响

以不同浓度的正丁醇萃取物处理菜籽油，以VC、TBHQ作为对照，测定油脂酸值与过氧化值，结果见图2。

图2 不同浓度正丁醇萃取物、VC和TBHQ的酸值和过氧化值测定Fig.2 Determination of acid value and peroxide value of n-butanol extract，VCand TBHQ with different concentrations

由图2可见，随着时间的延长，各处理的菜籽油酸值和过氧化值逐渐增大。第7天各处理对油脂酸值和过氧化值的抑制作用顺序均为0.02%TBHQ>0.05%正丁醇萃取物>0.04%正丁醇萃取物>0.03%正丁醇萃取物>0.02%VC>0.02%正丁醇萃取物>0.01%正丁醇萃取物>CK。图2a显示，随着正丁醇萃取物添加量的增加，对菜籽油酸败的抑制作用增强。在对照CK中，第7天酸值（4.66 mg/g）是第1天酸值（1.44 mg/g）的3.24倍；添加0.01%正丁醇萃取物的油脂第7天酸值（4.02 mg/g）是第1天酸值（1.27 mg/g）的3.17倍；而添加0.05%正丁醇萃取物的油脂第7天酸值（3.14 mg/g）是第1天酸值（1.39 mg/g）的2.26倍。对于已知的食品抗氧化剂VC和TBHQ，添加0.02%VC的油脂第7天酸值（3.62 mg/g）是第1天酸值（1.38 mg/g）的2.62倍，添加0.02%TBHQ的油脂第7天酸值（3.06 mg/g）是第1天酸值（1.32 mg/g）的2.32倍，与添加0.05%正丁醇萃取物的油脂酸值（acid value，AV）变化差异不大。从达到油脂酸败国标临界值（AV≤3 mg/g）的时间来看，处理第5天，对照CK酸值（3.31 mg/g）已超过临界值，而其他处理组均未超过临界值；处理第6天时，添加0.02%VC处理组的酸值已超过3 mg/g，达到3.49 mg/g，但添加0.05%正丁醇萃取物和0.02%TBHQ的油脂酸值分别为2.89 mg/g和2.45 mg/g，均未超过临界值，说明添加0.05%正丁醇萃取物抑制油脂酸败的效果优于添加0.02%VC，但与添加0.02%TBHQ相近。在第6天～第7天添加0.05%正丁醇萃取物的油样酸值达到临界值，第7天酸值超过临界值，为3.14 mg/g。由此认为添加一定浓度的核桃分心木正丁醇萃取物可有效抑制食用油脂酸败，且在0.01%～0.05%内样品添加浓度越高，油样酸价达到临界值所需要的时间越长。

由图2b可知，正丁醇萃取物对菜籽油的油脂过氧化有一定的抑制效果，且随着添加浓度的增大抑制效果增强。从过氧化值（peroxide value，POV）达到国标临界值（POV≤6 mmol/kg）的时间来看，在处理第5天，对照CK过氧化值（6.946 mmol/kg）已超过临界值，而其他处理组均未超过临界值；添加0.03%、0.04%、0.05%正丁醇萃取物和0.02%TBHQ的油脂，在处理第6天POV均未超过临界值，POV依次为 5.898、5.465、5.012、2.228 mmol/kg，但添加 0.02%VC的 POV 已超过6 mmol/kg，达到6.567 mmol/kg。添加0.05%正丁醇萃取物和0.02%TBHQ的油脂，第7天时POV未超过国标临界值，POV分别为5.913 mmol/kg和2.369 mmol/kg。这也说明添加0.05%正丁醇萃取物可有效抑制菜籽油的氧化作用。因此，以核桃分心木为原料开发天然抗氧化剂，不仅可综合利用核桃副产品资源，还可提高核桃的附加值，利用前景广阔。

3 结论

在不同供试浓度的乙醇溶液中，60%乙醇溶液为核桃分心木抗氧化活性物质的最适宜提取溶液。核桃分心木抗氧化活性物质富集相为乙醇溶液提取物的正丁醇萃取相，该萃取物具有较好的体外抗氧化活性，对ABTS+自由基的清除能力最强。正丁醇萃取物具有抑制菜籽油酸败和氧化作用。添加0.05%正丁醇萃取物第6天的抑制效果优于添加0.02%VC，与添加0.02%TBHQ相近；第7天其抑制菜籽油的氧化效果与添加0.02%TBHQ的相近，过氧化值未超过国标临界值。综上认为，核桃分心木乙醇溶液提取物具有较好的抗氧化活性，作为天然抗氧化剂来源在食用油脂抗氧化中具有广阔应用前景。