葡萄籽百香果啤酒发酵工艺优化

刘俐彤，汪洋帆，赵存朝，2，陶 亮，2*，田 洋，2，3

（1.云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.国家辣木加工技术研发专业中心，云南 昆明 650201；3.食药同源资源开发与利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201）

葡萄籽是葡萄加工过程中，种子、皮和茎榨汁后留下的固体残渣[1]。其富含多酚[2]、维生素[3]、花青素[4]、不饱和脂肪酸[5]等营养素，且具有抗癌[6]、抗炎[7]、抗氧化[8]等功效。百香果（Passiflora edulisSims）又称西番莲、巴西果、鸡蛋果，西番莲科西番莲属的草质藤本植物，生长于热带地区，原产地为巴西。其口感酸甜清爽，香味浓郁，富含维生素[9]，类胡萝卜素[10]以及酚类化合物[11]等多种营养素，有消除疲劳[12]、降脂降压[13]、消炎去斑[14]、护肝养颜[15]等神奇功效。目前学术界对葡萄籽的功效研究较多，加工工艺方面稍显欠缺，尚未达到提高葡萄废弃物利用率的目标。当前市场上常见的百香果加工产品主要包括饮料[16]、果酱[17]、果冻[18]、果脯[19]等，国内百香果啤酒的需求主要依赖于进口，相关研究相对匮乏。

啤酒是以大麦芽和小麦芽为主要原料，加以啤酒花，经过液态糊化和糖化，液态发酵酿制而成的一类饮品。果啤是指将水果用于啤酒酿造而得到的一种含酒精饮料[20]，近年来，因其清爽口感和低酒精度在国内外广受青睐。目前国内市场啤酒种类较为单一，大多以大麦为主要原料酿制啤酒[21]，不符合当下消费者多元化、品质化的消费需求。因此，国内外研究者将水果作为辅料加入啤酒中，一方面赋予啤酒水果独特香气，改善其直接食用的不悦口感[22]；另一方面使啤酒具有保健功效。由添加果蔬等原料所带来的天然生物活性物质，可减少酒精对人体机体的氧化和毒性作用[23]。除此之外，果啤还具有丰富的功能成分，能降低胆固醇、抑制脂肪生成、促进新陈代谢，在利尿、激发肝功能活性、美容养颜和护肤方面也具极佳效果[24]。目前，市场上常见的果味啤酒多以樱桃[25]、蓝莓[26]、西瓜[27]等作为辅料酿造，鲜见葡萄籽与百香果为辅料制作的果啤。考虑到综合利用葡萄籽及百香果，本试验拟以二者相复配酿制啤酒，研发一种利口、营养、新颖的果味啤酒。利用单因素试验考察混合主料（大麦芽、小麦与水）料液比、萨兹香型酒花添加量、混合辅料（葡萄籽、百香果与麦汁）料液比、初始pH值、酵母添加量和主发酵温度等因素对葡萄籽百香果啤酒感官评分的影响，并通过响应面优化葡萄籽百香果啤酒发酵工艺条件，借此拓宽啤酒市场生产链，降低啤酒企业成本，提高果蔬的综合利用率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大麦麦芽：市售；小麦、葡萄籽：沃尔玛超市；百香果：云南德宏天佑科技开发有限责任公司；萨兹香型酒花、马革努门苦型酒花：淄博塔斯曼酿酒原料有限公司；WB-06艾尔活性干酵母（干物质含量94.0%～96.5%，活细胞数＞6×109个/g）：费曼迪斯酵母有限公司；纤维素酶（酶活50U/mg）、果胶酶（酶活500 U/mg）：河南万邦实业有限公司。

1.2 仪器与设备

HJJ-6数显恒温水浴锅：常州华奥仪器制造有限公司；WT20002电子天平：杭州万特衡器有限公司；2500Y粉碎机：永康市铂欧五金制品有限公司；DPX-9162B-1恒温培养箱：上海福玛实验设备有限公司；WZB数显折光仪：上海仪电物理光学仪器有限公司；PAL-1糖度仪：日本ATAGO公司；J-001泡持杯：上海立昕国际贸易有限公司；Alpha Astree型电子舌系统：法国Alpha M.O.S.公司；PHS-25/3C酸度计：上海越平科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄籽百香果啤酒的加工工艺流程及操作要点

操作要点：

大麦芽、小麦粉碎：将大麦芽、小麦以质量比4∶1混合倒入对辊粉碎机中粉碎至皮破而不碎，作为主料混合物。

糖化：将粉碎大麦芽与小麦混合物以一定料液比加水分四阶段糖化，第一阶段边投料边搅拌，温度为35 ℃，恒温保持30 min；第二阶段升温至50 ℃，恒温保持30 min；第三阶段升温至65 ℃，恒温保持30 min（此阶段结束进行碘试，若碘试合格进行下一阶段，若不合格延长恒温时间直至碘试合格）；第四阶段升温至78 ℃，糖化结束。

麦汁过滤：把78 ℃的热水顶入过滤槽，以排出滤板及糟底内空气，避免麦汁氧化。将糖化醪液泵入过滤槽之后，静置20 min，分离凝固物。然后进行麦汁回流，以此加强麦汁的澄清度。过滤时观察过滤槽中糖化醪的情况，当刚刚露出糟层的时候，加入洗糟水洗糟。

麦汁煮沸、添加酒花：麦汁煮沸至100 ℃后，加盖避免其大量挥发，煮沸时间为45 min。麦汁煮沸时分2次添加酒花，第一次煮沸5 min后加入0.1%马革努门苦型酒花，第二次煮沸30 min后加入一定量萨兹香型酒花，再继续煮沸10 min后停止。

葡萄籽预处理：选择颗粒饱满、品质优良的葡萄籽投入洁净的流动水中清洗干净，在烘干箱105 ℃下烘干，打碎成粉，过100目不锈钢回转筛备用。

百香果汁制备：选取成熟度好、无病虫害、无腐烂、无机械损伤的百香果，去皮取果肉与水1∶1打浆，添加0.1%的果胶酶和纤维素酶，45 ℃酶解2 h，过滤后得到澄清的百香果汁，冷藏备用。

辅料混合：添加葡萄籽（40 g/L）和百香果汁按一定料液比例混合后作为辅料混合物适量添加到麦汁中。

接种：称取艾尔WB06型活性干酵母提前在25 ℃无菌水中以一定比例活化30 min 备用，接着轻轻搅拌30 min，将其添加到发酵罐中。

发酵：将制得的麦汁和辅料按一定比例混合后，搅拌均匀，在适宜的条件下进行主发酵。主发酵后期每日糖降小于0.3°Bx时进入后发酵，后发酵升温至13 ℃以还原双乙酰，当双乙酰含量降至0.1 mg/L以下时，即可过滤，得到葡萄籽百香果啤酒。

1.3.3 葡萄籽百香果啤酒发酵工艺优化

单因素试验：以感官评分及酒精度为评价指标，考察混合主料（大麦芽、小麦与水）料液比（1.0∶3.0、1.0∶3.5、1.0∶4.0、1.0∶4.5、1.0∶5.0（kg∶L））、萨兹香型酒花添加量（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L）、百香果汁添加量（40 g/L、60 g/L、80 g/L、100 g/L、120 g/L）、混合辅料（葡萄籽、百香果汁与麦汁）料液比（0.5∶1.0、1.0∶1.0、2.0∶1.0、3.0∶1.1、4.0∶1.0（kg∶L））、初始pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、酵母添加量（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）、主发酵温度（16 ℃、18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃）对葡萄籽百香果啤酒品质影响。

响应面试验[28]：以感官评分（Y）为响应值，选取混合主料料液比（X1）、萨兹香型酒花添加量（X2）、混合辅料料液比（X3）、主发酵温度（X4）4个因素，利用Box-Behnken试验设计进行4因素3水平试验，优化葡萄籽百香果啤酒发酵工艺。响应面试验因素与水平见表1。

表1 葡萄籽百香果啤酒发酵工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for grape seed and passion fruit beer fermentation process optimization

1.3.4 葡萄籽百香果啤酒感官评价

葡萄籽百香果啤酒的感官评定标准根据国标GB/T 4927—2008《啤酒》中的相关方法进行。由10名有一定品评经验的专业人员组成评定小组，分别从色泽（20分）、口感（40分）、气味（30分）、泡沫性能（10分）四项指标对葡萄籽百香果啤酒采用百分制打分。其感官评分标准见表2。

表2 葡萄籽百香果啤酒感官评分标准Table 2 Sensory scoring standards of grape seed and passion fruit beer

1.3.5 葡萄籽百香果啤酒产品理化及卫生指标测定

麦汁浓度测定：手持糖度仪；pH值测定：酸度计；酒精度的测定：参考国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；总酸的测定：参考国标GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》；细菌菌落计数：平板计数法；大肠菌群检测：最大或然数计数（most probable number，MPN）法。

葡萄籽百香果啤酒泡持性测定：将密封酒样缓慢打开，避免酒样有晃动，并沿杯口中心线匀速倒入泡持杯中，直到酒样泡沫即将溢出杯口时停止。同时立即用秒表对啤酒泡沫消减时间开始计时，直至酒样泡沫全部消失停止计时。整个过程需对酒样泡沫大小、细腻程度和泡沫上升情况进行记录，结果以整数表示，平行测定3次。

葡萄籽百香果啤酒滋味测定：取40 mL葡萄籽百香果啤酒，过滤后加入电子舌专用样品杯中。电子舌由8根化学传感器组成，能对酸味、咸味、鲜味、甜味、苦味、苦味回味、涩味及涩味回味具有专一响应性。数据采集前，对电子舌系统会进行活化、自检、校准等步骤。以Ag/AgCl作为参比电极，在室温条件下（25 ℃）进行数据采集，采集时间为120s、平行测定3次。

1.3.6 数据处理

采用Excel 2013、SPSS 19.0 统计软件对试验数据进行分析，利用Design-Expert 8.0.6 进行响应面分析，结果以均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 混合主料料液比的确定

由图1可知，混合主料料液比（大麦芽、小麦与水）在1.0∶3.0～1.0∶5.0（kg∶L）范围内，葡萄籽百香果啤酒酒精度呈持续下降趋势，原因可能是大麦芽与小麦混合主料的浓度降低，氮源和碳源含量减少，导致乙醇生成量减少，酒精度降低。酒精度在混合主料料液比为1.0∶3.0（kg∶L）时最高，为5.6% vol，但口感过于粗糙，酒香与麦芽香不平衡。感官评分呈先上升后下降的趋势，当混合主料料液比在1.0∶3.0～1.0∶4.0（kg∶L）时，感官评分随之增大；当混合主料料液比为1.0∶4.0（kg∶L）时，感官评分达到最高值，为（85.2±1.6）分；当混合主料料液比在1.0∶4.0～1.0∶5.0（kg∶L）时，感官评分呈下降趋势。混合主料料液比为1.0∶4.0（kg∶L）时，酒样麦芽香味突出，醇正浓厚，酒体协调无异味，因此，最佳混合主料料液比为1.0∶4.0（kg∶L）。

图1 混合主料料液比对葡萄籽百香果啤酒品质的影响Fig.1 Effect of solid and liquid ratio of mixed main materials on the quality of grape seed and passion fruit beer

2.1.2 萨兹香型酒花添加量的确定

由图2可知，随萨兹香型酒花添加量在0.2%～1.0%范围内的增加，葡萄籽百香果啤酒感官评分、酒精度呈现先增加后降低的趋势。萨兹香型酒花添加量达到0.6 g/L时，酒精度为最大值4.4% vol；萨兹香型酒花添加量为0.4 g/L时，感官评分达到最大值，为（86.1±0.98）分。萨兹香型酒花添加量过低时，口感偏甜，不能平衡麦芽甜味，泡沫稳定性不佳，抑制杂菌效果较差[29]；当其添加量过高，苦味值增加。萨兹香型酒花添加量为0.4 g/L时，酒样口感丰富，口味醇正，风味稳定，感官评分最高。因此，选择最佳萨兹香型酒花添加量为0.4 g/L。

图2 萨兹香型酒花添加量对葡萄籽百香果啤酒品质的影响Fig.2 Effect of Saze type hops addition on the quality of grape seed and passion fruit beer

2.1.3 百香果汁添加量的确定

由图3可知，当百香果汁添加量在40～120 g/L范围内增加时，葡萄籽百香果啤酒酒精度变化不明显，而感官评分呈先增加后下降趋势。当百香果汁添加量为80 g/L时，二者均达到最大值，分别为4.7% vol和（86±0.75）分。当百香果汁添加量较低时，百香果味不足，口感层次丰富度低；若其添加量过高，导致葡萄籽百香果啤酒整体口感偏酸，掩盖了啤酒本身麦芽香味。当百香果汁添加量为80 g/L时，果味突出，口感协调，麦芽香浓郁。因此，选择最佳百香果汁添加量为80 g/L。

图3 百香果汁添加量对葡萄籽百香果啤酒品质的影响Fig.3 Effect of passion fruit juice addition on the quality of grape seed and passion fruit beer

2.1.4 混合辅料料液比的确定

由图4可知，随混合辅料（葡萄籽、百香果汁∶麦汁）料液比的增加，葡萄籽百香果啤酒酒精度呈先增加后降低的趋势，可能是因为溶液总浓度的提升导致体系的不均匀，过高的浓度以及辅料带来的其余糖度也能对酵母菌及其他有益菌有抑菌作用，导致酵母酒精发酵降低，酒精度降低。感官评分随辅料比例的增加呈先下降后上升继而下降的趋势。混合辅料料液比为0.5∶1.0（kg∶L）和3.0∶1.0（kg∶L）时，葡萄籽百香果啤酒感官评分均较高，分别为（83±1.3）分、（86±0.94）分；混合辅料料液比为2.0∶1.0（kg∶L）时酒精度达到最高，为4.6% vol。混合辅料料液比为0.5∶1.0（kg∶L）时，葡萄籽与百香果汁添加量较少，二者成分溶解低，呈味及功效作用较小；而混合辅料料液比过高，易造成啤酒苦涩味增加。混合辅料料液比为3.0∶1.0（kg∶L）时，酒样口感饱满丰富，口味醇正，酒体协调无异味，感官评分最高。因此，最佳混合辅料料液比为3.0∶1.0（kg∶L）。

图4 混合辅料料液比对葡萄籽百香果啤酒品质的影响Fig.4 Effect of solid and liquid ratio of mixed auxiliary materials on the quality of grape seed and passion fruit beer

2.1.5 酵母添加量的确定

由图5可知，随着酵母添加量的增加，葡萄籽百香果啤酒感官评分、酒精度均呈现先上升后下降的趋势。酵母添加量较低时，可能会减少啤酒风味和香气的代谢副产物的生成，致使口感寡淡，营养成分损失；酵母添加过高可能造成异味，葡萄籽与百香果汁混合香气不足，感官品质下降。当酵母添加量为0.10%时，葡萄籽百香果啤酒酒精度、感官评分最高，分别为4.5% vol和（84±1.13）分，酒样有明显的酒香、麦香，口感丰富饱满。因此，选择最佳酵母添加量为0.10%。

图5 酵母添加量对葡萄籽百香果啤酒品质的影响Fig.5 Effect of yeast addition on the quality of grape seed passion fruit beer

2.1.6 初始pH值的确定

由图6可知，随初始pH值在3.5～5.5范围内的增加，葡萄籽百香果啤酒感官评分呈先上升后下降趋势，当初始pH值为5.0时感官评分达到最大值，为（83.4±0.43）分。葡萄籽百香果啤酒酒精度随初始pH值增加并无明显变化。pH的影响多集中于影响菌群生长的迟滞期；影响发酵时间的长短；影响代谢底物和终产物的种类和比例；影响胶体稳定性；对于酒精度的影响较小。当初始pH值较低时，葡萄籽百香果啤酒偏酸，发酵周期较长；初始pH值过高，导致葡萄籽百香果啤酒整体口感偏甜，无法突出果味。pH值控制在5.2～5.6也可以减少二甲基硫（dimethyl sulphide，DMS）的生成量[30]，以保证啤酒的风味质量。当初始pH值为5.0时，葡萄籽百香果啤酒酸甜适中，酒体平衡有层次感。因此，最佳初始pH值为5.0。

图6 初始pH值对葡萄籽百香果啤酒品质的影响Fig.6 Effect of initial pH on the quality of grape seed passion fruit beer

2.1.7 主发酵温度的确定

由图7可知，葡萄籽百香果啤酒感官评分随主发酵温度在16～24 ℃范围内的升高呈先上升后下降趋势。在主发酵温度为20 ℃时，感官评分最大，为（85.2±1.2）分；当主发酵温度达到22 ℃时，酒精度最大，为4.2% vol。主发酵温度较低时，葡萄籽百香果啤酒口味寡淡，发酵周期长；主发酵温度的提高虽可缩短发酵周期，但酵母将产生大量的酯类、高级醇等挥发性物质，严重影响啤酒的风味[31]。当主发酵温度为20 ℃时，葡萄籽百香果啤酒酒体圆滑爽口，平衡有层次感。因此，最佳主发酵温度为20 ℃。

图7 主发酵温度对葡萄籽百香果啤酒品质的影响Fig.7 Effect of main fermentation temperature on the quality of grape seed and passion fruit beer

2.2 葡萄籽百香果啤酒发酵工艺优化响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验优化葡萄籽百香果啤酒发酵条件

基于Box-Behnken试验设计，在单因素试验的基础上，利用Design Expert 8.0.6软件进行分析，选取混合主料料液比（X1）、萨兹香型酒花添加量（X2）、混合辅料料液比（X3）、主发酵温度（X4）4个因素，以感官评分（Y）为响应值，采用响应面试验对葡萄籽百香果啤酒加工工艺进行优化。试验设计及结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiments

2.2.2 模型的建立及显著性的检验

将所得试验数据利用Design Expert 8.0.6软件对各因素进行多元回归拟合，得到二次多元回归方程：Y=85.80+2.33X1+1.25X2-1.25X3+6.17X4-2.00X1X2+0.25X1X3+1.25X1X4-0.25X2X3-0.50X2X4+0.25X3X4-8.15X12-6.78X22-7.02X32-7.15X42

利用Design Expert 8.0.6软件对表3数据进行分析方差分析，结果见表4。

表4 拟合二次多项式模型的方差分析Table 4 Variance analysis of fitting quadratic polynomial model

续表

由表4可知，该回归模型的P值＜0.000 1，说明回归模型的影响达到极显著水平（P＜0.01）；感官评分回归模型失拟性检验P=0.822 4＞0.05，表明二次回归模型与实际试验拟合性充分，模型失拟项不显著，表明此模型可用于试验拟合。模型的决定系数R2=0.968 7，表明该模型能解析96.87%的响应变化，存在3.13%的总变异，说明该模型拟合程度相对较好，试验误差较小。校正决定系数R2Adj=0.9375，说明该模型响应值的变化有93.75%来源于所选变量。响应值Y的变异系数（coefficient of variation，CV）与试验精确度和重复性成反比，其变异系数CV=2.49%＜5%，说明试验的精确度和重复性较高，且可信度较高。

由回归系数显著性表明，在所取因素水平范围内，各因素对感官评分的影响顺序为：X4（主发酵温度）＞X1（混合主料料液比）＞X2（萨兹香型酒花添加量）=X3（混合辅料料液比）。

2.2.3 响应面试验优化葡萄籽百香果啤酒发酵工艺

由图8可知，响应面的变化情况和等高线的稀疏程度可直观地反映混合主料料液比（X1）、萨兹香型酒花添加量（X2）、混合辅料料液比（X3）、主发酵温度（X4）之间交互作用对葡萄籽百香果啤酒感官评分的影响。曲面图弧度变化越陡峭，等高线越密集且呈椭圆形或马鞍形时，表示两因素之间交互作用越显著。由表3可知，P=0.047 3＜0.05，交互项X1X2的曲面倾斜度较大，坡度较陡，且等高线呈椭圆形，较密集，说明其影响极显著（P＜0.01），反之，X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4影响不显著，各因素间交互作用对葡萄籽百香果啤酒的感官评分的影响大小依次为X1X2＞X1X4＞X2X4＞X1X3=X2X3=X3X4。

图8 各因素交互作用对葡萄籽百香果啤酒感官品质影响的响应面及等高线Fig.8 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory quality of grape seed and passion fruit beer

2.2.4 葡萄籽百香果啤酒最佳发酵工艺条件的确定和验证试验

通过Design Expert 8.0.6分析得到葡萄籽百香果啤酒的最佳酿造工艺条件为混合主料料液比1.0∶4.2（kg∶L），萨兹香型酒花添加量0.62 g/L，混合辅料料液比2.11∶1.00（kg∶L），主发酵温度21.77 ℃。在此优化条件下，葡萄籽百香果啤酒感官评分理论值为88.44分。考虑到实际操作的可行性，将发酵工艺参数调整为混合主料料液比1.0∶4.0（kg∶L），萨兹香型酒花添加量0.6 g/L，混合辅料料液比2.0∶1.0（kg∶L），发酵温度21 ℃。在上述最佳条件下进行验证试验，得到葡萄籽百香果啤酒感官评分实际值为（86.45±1.99）分，与理论值接近，具有一定的实际应用价值。

2.2.5 葡萄籽百香果啤酒理化和卫生指标

由表5可知，啤酒的理化指标和卫生指标均符合国家相关标准。成品葡萄籽百香果啤酒颜色呈琥珀色，酒样澄清无异物；香气富有层次感，麦香和百香果香味相互突显，泡沫洁白细腻；口感酸甜可口，酒体丰满，是一款安全卫生的烈性啤酒。

表5 葡萄籽百香果啤酒理化和卫生指标检测结果Table 5 Test results of physicochemical and hygienic indexes of grape seed and passion fruit beer

2.2.6 葡萄籽百香果啤酒味觉成分分析

啤酒电子舌分析结果见表6和图9。由表6和图9可知，电子舌的8个传感器对葡萄籽百香果啤酒的滋味均能做出不同程度的响应。与燕京啤酒进行比对，葡萄籽百香果啤酒主要包括酸味、咸味、苦味、鲜味、甜味，其中酸味、鲜味和甜味的响应值最强，涩味的响应值最弱，说明葡萄籽百香果啤酒的整体滋味偏甜和鲜，口感酸甜可口，丰富度饱满。结果表明，电子舌与评酒人员感官评分结果基本一致。

表6 葡萄籽百香果啤酒味觉强度指标响应值Table 6 Response value of taste intensity index of grape seed and passion fruit beer

图9 葡萄籽百香果啤酒味觉强度指标雷达图Fig.9 Radar chart of taste intensity index of grape seed and passion fruit beer

3 结论

在葡萄籽百香果果酒发酵过程中，混合主料料液比、萨兹香型酒花添加量、混合辅料料液比、主发酵温度对葡萄籽百香果啤酒感官评分均有显著影响，通过响应面优化得葡萄籽百香果啤酒的最佳工艺条件为：混合主料料液比1.0∶4.0（kg∶L），百香果汁添加量80 g/L，萨兹香型酒花添加量0.6 g/L，酵母添加量0.10%，混合辅料料液比2.0∶1.0（kg∶L），初始pH值5.0，主发酵温度21 ℃。此优化条件下，葡萄籽百香果啤酒感官评分为88.44分。本研究将为葡萄籽和百香果产业的深加工提供了依据，提高葡萄籽和百香果的经济价值，丰富了我国啤酒市场，为果味啤酒的开发利用提供基础。