葛根素对卡那霉素耳中毒小鼠耳蜗Calpain1活性的影响

卢伟 卫玲燕 任延鑫 李鑫宇 宝东艳

(锦州医科大学 1第一临床学院骨科，辽宁 锦州 121001；2第一临床学院2015级；3基础医学院生理学教研室)

听力障碍是世界主要健康问题之一。全世界每500名新生儿中就有1例患有听力障碍，65岁以上近1/3患有听力障碍〔1，2〕。由于耳蜗神经元和耳蜗毛细胞不能再生，耳毒性药物、噪声及年龄都可造成耳聋。钙蛋白酶(Calpain)是一类广泛分布于哺乳动物胞质中的钙依赖性半胱氨酸蛋白酶。Calpain1和Calpain2是此家族中研究最广泛的成员，都是由28和80 kD亚单位组成的异二聚体。近年来发现，在庆大霉素、丁胺卡那霉素及新霉素等氨基糖甙类诱导的内耳细胞死亡中有钙蛋白酶的参与〔3～5〕。前期研究发现，葛根素能拮抗卡那霉素(KM)的耳毒性，本实验通过制备KM耳中毒小鼠模型，结合听脑干反应观察葛根素对KM耳中毒的拮抗作用，同时探讨葛根素发挥作用是否与 Calpain1有关。

1 材料与方法

1.1实验动物 BALB/c雄性小鼠40只，体重25～30 g。由大连医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK( 辽) 2004-0029。

1.2主要试剂和仪器 葛根素注射液购自康普药业股份有限公司，批号H20043980。硫酸KM(粉剂)生理盐水溶解使用，购自美国 Ameresco公司，每日新鲜配制。兔抗Calpain1单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，β-actin 购自武汉博士德生物工程有限公司。Smart EP&OAE听觉诱发电位记录系统购自美国智听公司。

1.3分组及小鼠耳毒模型制备 BALB/c小鼠随机分成4组，每组10只。正常对照组：腹腔注射等量生理盐水；KM组：KM皮下注射 750 mg/kg，2次/d；KM+葛根素组：皮下注射KM 750 mg/kg，2次/d，同时腹腔注射葛根素200 mg/kg，1次/d；葛根素组：腹腔注射葛根素200 mg/kg，1次/d，4组均连续注射14 d，14 d内每天监测体重，根据体重调整药量。

1.4听脑干反应(ABR)测试 ABR测试需要在隔音屏蔽室内进行，同时注意动物保温。用药前测ABR以进行正常BALB/c小鼠的筛选，每种药物停药后分别测ABR进行听力损伤后听阈的测定。测定ABR的方法：小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠100 mg/kg，在小鼠颅顶正中皮下插入电极的正极，给声侧耳郭下插入负极，在对侧耳郭后下插入接地电极，用听觉诱发电位记录系统给予小鼠短纯音刺激，依次选取8、12、24 kHz进行测试，记录小鼠ABR阈值的变化，短纯音刺激从80 dB开始，以5 dB逐次递减，刚出现ABRⅠ波的值为听阈标准，每只小鼠每侧耳至少重复2次。

1.5Western印迹 实验结束后，分别测试ABR，断头处死小鼠后，迅速取出听泡，之后取出听泡内的小鼠耳蜗组织，迅速置于液氮中，放入-80℃冰箱中备用。按照Western印迹说明书操作，加入裂解液后匀浆，离心5 min后取上清，加入缓冲液后离心，变性。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转移至硝酸纤维素膜上。封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜，加入二抗，发光显影，计算Calpain1/β-actin作为蛋白相对表达量。

1.6统计学方法 应用SPSS22.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组ABR阈值比较 停药后，KM组3种频率的ABR阈值较给药前明显提高，提示小鼠的听力下降，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；KM+葛根素组ABR阈值较正常对照组升高，但低于KM组，差异有统计学意义(P<0.01)。葛根素组停药后较给药前听力无明显变化(P>0.05)，见表1。

表1 各组脑干听觉阈值

2.2Western印迹检测Calpain1蛋白表达 KM 组(0.69±0.13)与正常对照组(0.48±0.12)比较，Calpain1表达水平明显升高(P<0.05)。KM+葛根素组(0.58±0.14)明显高于正常对照组，但明显低于KM组(P<0.05)。正常对照组与葛根素组(0.50±0.12)差异不显著(P>0.05)，见图1。

图1 各组Calpain1蛋白表达

3 讨 论

虽然KM等氨基甙类抗生素在临床上广泛应用于治疗危及生命的细菌性感染，但KM有显著的剂量依赖性耳毒性〔6〕。目前认为，氨基甙类药物的主要耳毒性靶点是毛细胞，毛细胞死亡后，螺旋神经节神经元在数周或数月开始退化。随着氨基甙类用药剂量或用药时间的延长，首先损伤毛细胞高频基底部，低频的尖端随后损伤〔7〕。氨基甙类诱导的毛细胞变性被认为是与活性氧(ROS)介导的凋亡有关〔8，9〕。

虽然Calpain在许多细胞功能中起重要作用，但其过度激活已被证明与许多疾病有关。在已鉴定的15种Calpain亚型中，Calpain1和Calpain2(又名m-calpain)广泛分布于包括耳蜗在内的大多数组织和器官中〔10〕。Calpain是钙敏感的中性半胱氨酸蛋白酶，参与凋亡和坏死途径的调节〔11，12〕。Calpain1与内耳细胞凋亡的相关性表明，Calpain1很可能是KM诱导内耳细胞凋亡的介质〔13〕。本研究结果提示Calpain1介导了KM的耳毒性，与Li等〔13〕结果一致。

葛根原产于东南亚，几千年来一直被用作食物、药物和饲料，是中国古代最早使用的草药之一〔14〕。葛根素是从葛根中分离出来的3种主要的异黄酮化合物之一〔15〕，已被广泛用于治疗心血管疾病、脑血管疾病、癌症、帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、糖尿病及糖尿病并发症。对发热、炎症、高脂血症、骨坏死、酒精引起的疾病和氧化损伤也有保护作用。葛根素具有抑制钙内流、改善微循环、降低胰岛素抵抗、清除氧自由基、抗细胞死亡、抑制酒精摄入等多种药理作用。

临床报道葛根素能改善内耳的血液循环，扩张血管，治疗突发性耳聋和神经性耳鸣有明显疗效〔16〕。不同浓度组葛根素均能拮抗庆大霉素对离体小鼠耳蜗的损伤〔17〕。同时，葛根素可有效抑制顺铂所致小鼠耳蜗Calpain2的高表达，以减轻顺铂的耳毒性，改善小鼠听功能。前期研究表明〔18，19〕，葛根素能通过拮抗核因子(NF)-κB p50和NF-κB p65的活化易位，改善KM所致的小鼠耳毒性。本研究结果表明，同时应用KM和葛根素小鼠耳蜗表达Calpain1明显减少，同时听力损伤也有所改善，提示葛根素对KM损伤小鼠耳蜗的保护作用可能与下调Calpain1有关，葛根素单独应用对小鼠听力无损害，因此，葛根素具有广阔的应用前景。