曲妥珠单抗耐药机制的研究进展

徐 琦，房德敏

（天津市天津医院，天津 300211）

乳腺癌是女性发病率居首的恶性肿瘤，近年来随着工作生活习惯改变、诊断检测技术的提高，其发病率有逐年上升趋势，发病人群也趋于年轻化，严重影响患者身心健康，同时也给患者家庭带来灾难，需积极治疗。化疗是乳腺癌治疗及辅助治疗的重要手段，针对性的靶向治疗对提升预后具有重要意义。但随着研究的深入，发现部分患者存在治疗失败现象。随着病理学和基础医学的不断发展，对乳腺癌的发病机制有了更多了解。研究表明，乳腺癌的发病机制与多种分子异常表达相关，而这种分子表达的高度异质性也是导致治疗失败的重要原因。乳腺癌大致分为HER2阳性乳腺癌、激素受体阳性乳腺癌和三阴性乳腺癌；乳腺癌患者中约有30%左右的患者为HER2阳性乳腺癌，此类患者恶性程度高且预后差，因此，临床也针对此类患者研发了靶向抗癌药物［1-2］。曲妥珠单抗是针对HER2研发的一种人源化单克隆抗体，对HER2阳性乳腺癌患者具有较好的治疗效果，1998年由FDA批准上市，在我国于2002年上市，为HER2阳性乳腺癌患者的治疗提供了新希望，显著提升了生存率及无病生存期。但临床实际应用中发现，约有30%的HER2阳性乳腺癌患者对曲妥珠单抗不敏感，且有部分患者在采用曲妥珠单抗治疗1年后会出现耐药性，严重影响治疗效果［3-4］；因此研究曲妥珠单抗的耐药机制显得尤为重要。现就曲妥珠单抗的可能耐药机制进行阐述，为临床制定耐曲妥珠单抗的HER2阳性乳腺癌患者的治疗方案提供更多参考。

1 曲妥珠单抗的作用机制

HER2是由位于17号染色体上的C-erbB2编码的一种跨膜糖蛋白，具有受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）活性，可通过相应信号通路抑制细胞凋亡，同时促进细胞增殖；当HER2过表达时通过激活胞内Ras/Raf/MAPK/MEK/PI3K/（JAK-STAT）等多种信号通路途径参与肿瘤的增殖、侵袭、转移等过程［5-6］。

曲妥珠单抗作为针对HER2的特异性单抗，其主要作用机制为通过与HER2胞外段靶向结合，可能通过以下途径抑制肿瘤增殖、侵袭、转移等。首先抑制HER2进行二聚化、阻断mTORC2、mTORC1、MAPK、PI3K等信号通路，进而诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖；同时抑制P27kip1的形成及细胞周期蛋白D1表达，进而诱导细胞凋亡［7］；其次，可通过抑制细胞合成血管表皮生长因子、上调细胞抗血管生成因子表达，进而抑制肿瘤血管新生，达到抑制肿瘤生长的目的［8］；再次，可激活抗体依赖的ADCC，通过细胞自身ADCC作用诱导肿瘤细胞凋亡；最后可增加细胞对HER2受体的内吞作用，进而增加其被溶酶体降解，最终导致细胞降低HER2表达量，从根源上解决HER2过表达的问题［9］。

2 曲妥珠单抗耐药机制

曲妥珠单抗耐药主要分为原发性耐药和获得性耐药，原发性耐药是指HER2阳性乳腺肿瘤患者在首次接受曲妥珠单抗治疗就出现不敏感现象，获得性耐药是指HER2阳性乳腺肿瘤患者在首次接受曲妥珠单抗治疗有反应，但在接受一线治疗3个月内出现病情进展或术后接受曲妥珠单抗辅助治疗1年内出现癌症复发。有研究发现，约有60%的HER2阳性转移性乳腺癌患者对曲妥珠单抗耐药，而HER2阳性转移性乳腺癌患者中约有80%的患者会出现获得性耐药［10-11］；耐药问题相对普遍且棘手，了解其耐药机制对临床制定针对性治疗策略意义重大。随着基础医学、生物医学等的发展，目前，对曲妥珠单抗的耐药机制有了初步了解，但仍不是完全清楚。

2.1 PI3K通路相关机制PI3K/AKT通路是曲妥珠单抗发挥抑制肿瘤的一条重要途径，该通路是否能被充分抑制是决定曲妥珠单抗疗效的决定因素之一。PI3K/AKT通路的异常活化是肿瘤发生发展及耐药发生的重要因素［12］，因此为何会出现该通路的异常活化是寻找耐药机制的重中之重。早在2014年就有研究发现，通过对接受以曲妥珠单抗为基础的治疗的HER2阳性晚期乳腺癌患者进行为期3年的随访发现，PI3K/AKT通路相关基因的突变是导致耐药发生的关键，而突变位点越多，PI3K/AKT通路的异常活化也高。后续研究发现，基因突变最常见的位点为PIK3CA基因的第9和第20外显子处，占据该基因突变位点的80%以上，这两个外显子编码重要的酶结构域，因此，一旦突变将导致PI3K/AKT通路的异常活化［13-14］。有研究表明，504例接受曲妥珠单抗治疗的乳腺癌患者的PIK3CA突变情况、治疗效果及两者间的关系进行分析，结果显示，约有21.4%的患者出现PIK3CA突变，疗效存在群体差异，PIK3CA突变型患者病理缓解率显著低于PIK3CA野生型（19.4% vs 32.8%，P<0.05）［15］。Katrien等［16］通过对乳腺癌细胞进行大规模的RNA干扰实验发现，PIK3CA的突变与曲妥珠单抗的耐药性相关；同时对55例乳腺癌患者的临床资料进行分析发现，PIK3CA的突变与乳腺癌患者采用曲妥珠单抗治疗的预后密切相关，接受曲妥珠单抗治疗的PIK3CA突变型乳腺癌患者较PIK3CA野生型乳腺癌患者预后更差。Anindita等［17］基于PI3K在HER2阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药发生机制中的作用，采用XL147（pan-PI3K抑制剂）作为实验试剂，研究发现，XL147作用于曲妥珠单抗耐药HER2阳性乳腺癌细胞可引发细胞凋亡，引发凋亡的机制主要是调节抗凋亡基因birc5和癌症干细胞相关因子的表达；因此，实验者推测在HER2阳性肿瘤细胞中采用曲妥珠单抗和PI3K抑制剂共同作用可减低细胞发生曲妥珠单抗获得性耐药的风险。Tang等［18］基于PI3K/AKT抑制剂XL147和曲妥珠单抗联合使用以确定HER2阳性肿瘤细胞调控PI3K/AKT通路参与曲妥珠单抗耐药性的上游基因，结果发现正常上皮细胞特异性基因1（KLK10）是一种潜在靶向位点；sgc7901-tr和bgc-823-tr细胞系（曲妥珠单抗耐药细胞株）中均检测到KLK10基因表达上调，而当对细胞中KLK10基因表达进行下调时细胞对曲妥珠单抗的耐药性将被逆转，KLK10过表达可激活PI3K/AKT信号通路诱导细胞发生对曲妥珠单抗的耐药性。由此可见，PI3K/AKT信号通路在细胞发生曲妥珠单抗耐药的发生过程中扮演重要角色，且KLK10可作为疾病治疗的潜在靶向位点。PI3K/AKT信号通路是HER2阳性乳腺癌细胞产生曲妥珠单抗耐药机制的关键环节，很多分子、蛋白等均通过该通路发挥作用，因此，PI3K/AKT信号通路也是疾病治疗的重要靶向位点。

既往研究中发现，AKT基因突变并不常见，但各种原因导致的异常扩增却在耐曲妥珠单抗HER2阳性乳腺癌患者中常见。也有研究表明，在AKT活性异常增加的耐曲妥珠单抗HER2阳性乳腺癌患者中采用AKT抑制剂可显著降低耐药性，提高患者对曲妥珠单抗的敏感性。Fu等［19］通过微小RNA作用于乳腺癌细胞，旨在探讨乳腺癌细胞耐曲妥珠单抗的可能机制，研究发现抗曲妥珠单抗的细胞系SKBR3/TR和BT474/TR中miR-126表达显著降低，因此将miR-126作为目标微小RNA；而在SKBR3亲代细胞对miR-126的表达进行抑制后细胞入侵和迁移能力增加，对曲妥珠单抗的耐药性增强。进一步研究发现，miR-126参与细胞曲妥珠单抗耐药的可能机制为调节PIK3R2/PI3K/AKT信号通路活性，也间接说明AKT表达的改变在曲妥珠单抗耐药发生中发挥重要作用。Qiu等［20］研究发现，曲妥珠单抗耐药的HER2阳性乳腺癌细胞中出现IGF-1R/IRS-1通路的抑制剂Cullin7的过度表达，因此将Cullin7作为研究对象，发现下调细胞中Cullin7的表达可显著抑制PI3K/AKT通路的激活，使曲妥珠单抗耐药的HER2阳性乳腺癌细胞重新获得对曲妥珠单抗的敏感性。

由此可见，无论通过哪种分子或途径作用于HER2阳性乳腺癌细胞的曲妥珠单抗耐药性，PI3K/AKT通路都是此耐药发生机制中不可逾越的一个通路，后续药物研发中可将其作为一个有效的靶点进行研究。

2.2 HER家族受体介导信号传导的上调p95HER2编码的是HER2上膜连接片段的基因序列，属于HER2羧基末端，该片段仍具有激酶活性但缺失胞外结构域，无法识别曲妥珠单抗进行有效结合，因此，p95HER2表达异常与曲妥珠单抗疗的疗效及耐药相关。已有研究证实，p95HER2高表达会导致接受曲妥珠单抗治疗的HER2阳性转移性乳腺癌患者出现不良预后。Chumsri等［21］做了一项研究，作为HER2截短型的p95HER2，体外研究已经证实其在曲妥珠单抗耐药性产生过程中发挥重要作用，此次研究在临床上对转移性乳腺癌患者体内的p95HER2/HER2比例及使用曲妥珠单抗治疗结果进行分析，结果显示，p95HER2/HER2比值越高，使用曲妥珠单抗治疗的转移性乳腺癌患者的预后越差，也推测p95HER2/HER2比值可作为预测针对HER2进行靶向治疗预后的潜在指标。

另有研究发现，在部分耐曲妥珠单抗的乳腺癌患者中存在细胞表面黏蛋白4（Muc4）过表达，而Muc4在小鼠研究中发现可能会覆盖HER2上与曲妥珠单抗的结合位点，降低曲妥珠单抗与HER2的结合，进而导致预后不良，导致耐药发生；另有研究发现，Muc4还可能通过与HER2结合促进其磷酸化进而激活下游基因，导致耐药发生。Maria等［22］对接受曲妥珠单抗和辅助化疗进行治疗的HER2阳性乳腺癌患者进行研究，发现Impc患者接受曲妥珠单抗治疗的无病生存率显著低于普通型HER2阳性乳腺癌患者，而Muc4在Impc患者中具有特异性的高表达，因此，Muc4也作为检测曲妥珠单抗治疗敏感性的一种标志物，对Muc4阳性或高表达的患者应加强治疗期间的观测，同时也应考虑其他治疗方案。Muc4的异常表达对肿瘤细胞的增殖、粘附和侵袭等均具有促进作用，也有学者曾提出Muc4主要通过HER2受体酪氨酸激酶途径来参与肿瘤的发生发展。Rowson-Hode等［23］通过建立Muc4基因沉默的小鼠，之后与neu缺失突变小鼠杂交得到Muc4ko/ndl小鼠；与Muc4wt/ndl小鼠相比，Muc4ko/ndl雌鼠原发性乳腺肿瘤的潜伏期和生长速度并未发生明显改变，但肺转移的发生明显被抑制，此外，研究还证实Muc4可通过促进循环肿瘤细胞与血细胞之间的相互作用来保证肿瘤细胞在循环中存活并顺利进行转移。

EGFR家族包括4个成员，成员间可相互结合激活下游信号通路发挥作用；因此，当HER2阳性患者体内有其他EGFR家族成员过表达时曲妥珠单抗作用将被降低，导致耐药发生［24-25］。

2.3 PTEN介导的耐药机制PTEN是一种抑癌基因，与PI3K的作用相拮抗，可特异性的使PIP3去磷酸化，因此，导致胞内AKT的活化被抑制，在曲妥珠单抗作用于肌体后会导致PTEN持续性的处于磷酸化水平，其磷酸酶活性也相对增强，进而抑制癌症进展；当PTEN因各种原因活性降低时，对PI3K/AKT通路的调控作用也相应减弱，因此，曲妥珠单抗的治疗效果也降低，导致耐药发生。Liu等［26］通过小型非编码RNA技术进行转座子基因元件的沉默，研究发现在乳腺癌组织和细胞系中piR-651的过表达可抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和侵袭，同时还会使Cyclin D1、CKD4、MDM2等基因表达上调，此外，piR-651还有一项重要作用，可通过和其他分子形成复合物后促进DNMT1介导的PTEN基因启动子甲基化，进而促进乳腺癌细胞的增殖和迁移、诱导细胞凋亡，由此可见PTEN活性的缺失对乳腺癌预后不利。Kemal等［27］将100例接受曲妥珠单抗治疗的HER2阳性转移性乳腺癌患者的病理资料、PI3K及PTEN表达情况进行分析，结果显示，42%的患者存在PI3K表达，而43%的患者出现PTEN丢失，PTEN阳性较PTEN阴性的HER2阳性转移性乳腺癌患者对曲妥珠单抗的敏感性更高，无进展生存率也显著延长（15.3个月vs 12.1个月，P=0.04）；PI3K的表达与否对患者对曲妥珠单抗反应的敏感性和治疗预后影响不大。

2.4 IGF-1R介导的耐药机制IGF-1R属于跨膜酪氨酸激酶受体的一种，在乳腺癌细胞中主要通过对PI3K/AKT通路的旁路活化发挥调控细胞增殖等的作者用；由于作用通路一致，IGF-1R对曲妥珠单抗耐药机制可能与HER2相同；有研究表明，在SKBR3细胞中IGF-1R过渡表达可导致细胞对曲妥珠单抗耐药，而将加入IGF结合蛋白3后这种耐药性消失，细胞又开始对曲妥珠单抗敏感。Lu等［28］研究发现，在MCF-7/HER2-18和SKBR3中采用曲妥珠单抗（10 mg/ml）和IGF-1（40 ng/ml）进行处理，结果显示，曲妥珠单抗对MCF-7/HER2-18细胞的生长具有显著的抑制作用，IGF-1对MCF-7/HER2-18细胞中HER2/neu受体和的过表达具有显著抑制作用；而在HER2/neu受体过表达的SKBR3细胞中，曲妥珠单抗对SKBR3细胞增殖的抑制率为42%，且这种抑制不受IGF-1的影响；而在SKBR3细胞转基因过度表达IGF-1R并与IGF-1联合培养时，曲妥珠单抗对细胞增殖无影响；由此可以推测IGF-1R信号增强似乎干扰了曲妥珠单抗的作用。但也有研究不认同这个观点，认为IGF-1R的表达与曲妥珠单抗的临床敏感性之间没有必然联系，因此，后续仍需进一步进行研究。

2.5 LncRNA分子介导的耐药机制LncRNA属于一种非编码RNA，长度一般在200个核苷酸以上，在细胞中如果LncRNA表达异常则可能通过顺式、反式作用对临近乃至远端的基因表达做出调控；近年来已发现LncRNA与结肠癌、胃癌等多种癌症的耐药性相关。随着对乳腺癌耐药性的研究深入，目前已有多项研究证实多种LncRNA通过顺式、反式作用、内源性竞争作用、外泌体介导等多种机制参与到乳腺癌患者耐曲妥珠单抗中［29-31］。

Dong等［31］采用连续移植的方式利用HER2+SKBR3和BT474细胞建立抗曲妥珠单抗的乳腺癌细胞系，通过基因芯片技术发现LncRNA-snhg14在乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药的发生过程中发挥重要作用，进一步研究发现抑制LncRNA-snhg14可明显促进曲妥珠单抗诱导的细胞毒性，用高表达LncRNA-snhg14的外泌体治疗敏感细胞，可诱导对曲妥珠单抗的耐药性，剔除LncRNA-snhg14后这种效应将会消除；基因芯片的研究结果也发现LncRNA-snhg14促进曲妥珠单抗药理作用的机制可能是靶向调控凋亡调节因子Bcl-2/凋亡调节因子Bax信号通路；此外，体内研究发现，在HER2阳性乳腺癌患者中，与曲妥珠单抗敏感型患者相比，曲妥珠单抗耐药型患者血清外染色体LncRNA-snhg14的表达水平上升；由此可见，LncRNA-snhg14与HER2阳性乳腺癌患者曲妥珠单抗耐药发生密切相关，也有望成为HER2阳性乳腺癌患者治疗的新靶点。Dong等［32］研究发现，在乳腺癌组织中LncRNA-snhg14表达上调，进一步研究发现，在细胞内过表达LncRNA-snhg14时细胞增殖、侵袭能力加强，且会出现对曲妥珠单抗的耐药性，抑制LncRNAsnhg14的表达时细胞增殖、侵袭能力下降，且细胞耐药性也会得到逆转；而LncRNA-snhg14参与HER2阳性乳腺癌细胞发生曲妥珠单抗耐药的机制可能是通过PABPC1-NRF2信号通路；由此可见，LncRNAsnhg14可能成为乳腺癌患者的一个新的诊断和治疗靶点。Han等［33］将曲妥珠单抗敏感的HER2阳性乳腺癌细胞和曲妥珠单抗耐药的HER2阳性乳腺癌细胞中LncRNA AFAP1-AS1的表达量采用基因芯片进行分析，结果显示，与曲妥珠单抗敏感的HER2阳性乳腺癌细胞相比，曲妥珠单抗耐药细胞中AFAP1-AS1表达量更高，对细胞中AFAP1-AS1启动子区采用H3K27ac进行修饰可逆转细胞对曲妥珠单抗的耐药性，同时也发现AFAP1-AS1可通过外泌体形式在细胞之间进行传递；因此，对患者AFAP1-AS1水平进行检测有利于对患者是否会出现曲妥珠单抗耐药性及治疗效果进行预测。

近年来，随着研究的不断深入，有越来越多的LncRNA被发现与HER2阳性乳腺癌患者曲妥珠单抗耐药相关；此方向也为曲妥珠单抗耐药型HER2阳性乳腺癌患者的靶向治疗和预后预测提供了新的方向和思路。

3 展望

曲妥珠单抗自1998年批准上市以来在HER2阳性乳腺癌患者中得到广泛应用，临床疗效也得到肯定；但随着临床应用的不断推广，耐药性成了影响曲妥珠单抗治疗效果的重要因素。HER2阳性乳腺癌患者中约有50%出现原发或获得性耐药，导致治疗失败。曲妥珠单抗耐药的发生与多种基因的异常表达及通路的异常激活密切相关，如PI3K/AKT通路、HER家族受体、细胞因子、非编码RNA等。针对已有机制临床可进行针对性的研究，制定更具针对性的治疗方案，提升疗效和预后。但就曲妥珠单抗耐药机制目前仍有很多问题并未得到解决，因此，后续仍需进行机制研究，以更好地掌握曲妥珠单抗耐药机制，为药物研发和临床治疗方案制定提供更多依据。