蔬菜疫病抗性鉴定技术研究进展

王 瑞，金庆敏，杨晓珊，吴廷全

（广东省农业科学院蔬菜研究所/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广东 广州 510640）

疫霉菌属（Phytophthorade Bary）卵菌，隶属于藻界（Chromista）卵菌门（Oomycota）卵菌纲（Oomycetes）霜霉目（Peronosporales）腐霉科（Pythiaceae）疫 霉 属（Phytophthora）［1］，是一群重要的植物病原菌，由该菌所致的植物病害通常称为“疫病”，是一种毁灭性病害，主要危害的蔬菜作物有马铃薯、番茄、辣椒、黄瓜、冬瓜、南瓜、芋头等。疫霉菌在世界范围内广泛分布，可致被感染体坏死、软腐和枯萎，造成植株成片枯死与毁灭，流行年份造成的损失轻则15%～30%，重达50%以上，甚至绝收［2］。特别是在华南地区春季低温高湿、夏季高温多雨的气候条件下极易引起疫病暴发，给蔬菜生产造成较大经济损失。目前对蔬菜疫病的防治主要以药剂防治与栽培抗疫病或耐病品种相结合，但大量使用化学农药，不仅易引起各种病原菌抗药性增强，还会使蔬菜产品中农药残留增加，极大影响蔬菜品质和安全性，甚至造成环境污染，限制蔬菜产业的可持续发展［3］。选育高抗疫病新品种是抵御蔬菜疫病最经济、有效的途径，而种质资源的抗病性鉴定和筛选是抗病育种的前提和保障，创建一项快速准确的鉴定技术体系是了解种质资源抗性的重要前提，也是抗病育种工作的重要工具。对于蔬菜疫病抗性育种工作，国内外学者在鉴定方法方面做了大量工作［4-8］，由于引起不同蔬菜产生疫病的疫霉菌种类不完全相同，因此，不同种类的蔬菜作物在疫病抗性鉴定方法上存在较大差异。另外，由于气候条件、发病条件不同，研究方法也存在差异，同份材料不同地域的鉴定结果也存在较大差异。本文以茄果类（马铃薯、番茄、辣椒）、瓜类（黄瓜、冬瓜、西瓜）及芋类蔬菜为代表，对其疫病抗性鉴定方法进行全面总结，对目前存在问题进行分析，并对未来发展方向进行展望，旨在为蔬菜疫病抗性鉴定及抗疫病育种工作提供科学依据。

1 茄果类蔬菜疫病抗性鉴定方法

马铃薯、番茄、辣椒等是重要的茄科蔬菜作物，疫病是其最重要的病害之一。侵染马铃薯和番茄的致病疫霉均为Phytophthora infestans（Mont.）de Bary［8］，由此菌所致的病害称为“晚疫病”。而侵染辣椒的疫霉菌为Phytophthora capsiciL［9］，由此菌所致的辣椒病害称为“辣椒疫病”。在我国南方，茄果类蔬菜疫病发生严重，对茄科蔬菜产业的发展造成严重障碍。

1.1 马铃薯晚疫病抗性鉴定

目前，马铃薯抗疫病鉴定方面已有大量报道，主要方法为：（1）田间自然抗性鉴定法：即利用田间自然发病状态进行抗病性鉴定，一般会选择多年种地块，选择合适的发病气候条件进行筛选鉴定。Stewart 等［10］比较了田间鉴定和温室鉴定的关键影响因素，认为播种季节、接种苗龄和栽培密度影响马铃薯的田间抗性，如在春季鉴定比夏季鉴定更抗病；5～7 周苗龄接种比4 周苗龄时表现更抗病；栽培密度小比密度大更抗病。田祚茂等［11］利用田间鉴定法对709 份马铃薯种质资源进行抗性评价，筛选到84 份高抗材料、51份抗病材料、574 份感病材料。金光辉［12］对24个抗晚疫病的马铃薯品种进行田间抗性鉴定，研究不同抗性资源的抗性稳定性和持久性，结果显示某些品种的地上部茎叶抗病性与地下部块茎抗病性不一致，茎叶抗性与块茎抗性分别受控于不同基因。王鹏等［13］对来自全国38 份马铃薯品种（系）进行晚疫病抗性的田间鉴定，筛选出两份田间抗性和丰产性较好的材料。唐建锋等［14］对贵州12 个马铃薯品种的抗性及产量进行初步评价，发现参试品种抗性综合评价为感病至高感。李威等［15］对10 个马铃薯品种抗晚疫病田间自然诱发鉴定，表现中抗的品种2 个，表现中感的3 个，表现感病的2 个，表现高感的3 个。

（2）离体叶片鉴定法：即采摘5～7 叶期无病斑叶片，背面朝上置于培养皿中，用移液枪吸取20 μL 游动孢子悬浮液接种在叶片背面，测量病斑面积，采用5 级分级标准进行评价。20 世纪60 年代，国外学者已建立叶片离体检测法［5,8］，Vivianne 等［16］比较了离体叶片鉴定与田间鉴定及其他方法的有效性，指出离体叶片鉴定的感病程度高于田间整株鉴定。李华青［7］采用室内离体叶片接种法和室内成株接种法对100 份马铃薯种质资源进行晚疫病抗性评价，其中9 份高抗、15 份中抗、44 份抗、23 份感病、9 份高感，两种方法鉴定结果基本一致。娄树宝等［17］采用离体叶片法对49 个马铃薯栽培品种和13 个野生种进行室内晚疫病菌混合生理小种接种鉴定，49 个栽培品种中没有发现高抗品种，其中7 个表现抗病，11 个表现中抗，18 个表现感病，而13 个野生种表现高感；对从国际马铃薯中心引进的资源及其后代进行抗性鉴定，从103 份材料中鉴定高抗材料8 份、抗病材料12 份，认为离体接种鉴定法更准确［18］。余小玲［19］采用离体接种法，对来自国内外370 份马铃薯育种材料进行多轮抗性鉴定，筛选出中抗及以上的晚疫病抗性材料50份。王洪洋等［20］利用离体叶片接种法对43 份马铃薯种质资源进行晚疫病抗性鉴定、比较和评价，鉴定出5 份高抗和14 份中抗种质资源材料。离体叶片接种法因易于操作，环境因素可控，应用比较广泛，在病原菌与寄主互作相关研究方面大多采用该方法［21］。

（3）薯块鉴定法：马铃薯晚疫病抗病性可分为植株抗性和块茎抗性，地上植株与地下块茎对晚疫病的抗病性表现并不一致［22-23］，仅对地上部分进行鉴定筛选，不能够真实反映该资源的整体抗性。基于此，研究者开发了薯块鉴定法。块茎晚疫病抗性的鉴定可分为自然接种和人工接种方式两类。人工接种法分为整薯接种法和块茎薄片接种法。田振东等［24］发现块茎薄片接种法要求无菌操作，易发生杂菌污染，导致薯片腐烂，影响鉴定结果，注射法接种效果最好。王仁贵等［25］认为整薯受伤接种法更加简单、易操作。也有学者认为利用室内块茎薄片鉴定法可以忽略薯皮对致病疫霉的抗性，更清晰反映薯块抗性［26］。王腾［27］利用6 个不同生理小种类型对9 个晚疫病抗源材料进行块茎抗性鉴定，共鉴别出3 个抗性品种，均表现中抗，且与3 个品种的植株抗性基本相同。敖翔等［28］利用5 个菌株对13 个无性系马铃薯材料进行晚疫病块茎薄片法抗性鉴定，发现其中高抗1 份、中抗2 份、感病6 份、高感4 份。夏艳涛等［29］利用室内薯片接种鉴定法对黑龙江7个马铃薯主栽品种进行晚疫病抗性鉴定，结果5 个品种表现中抗，2 个品种表现感病，与田间发病抗性略有不同。

多数情况下，使用不同抗性鉴定方法鉴定相同材料，可以得出相同或相近结果。而少数情况下，使用不同抗性鉴定方法鉴定相同材料，会产生相异的鉴定结果，如果出现鉴定结果相异的情况，需采用多种方法联合分析，最终鉴定种质资源的抗性。

1.2 番茄晚疫病抗性鉴定

番茄晚疫病与马铃薯晚疫病致病菌为不同生理小种的致病疫霉，其鉴定方法与马铃薯相似，目前常用的有田间自然发病鉴定法、苗期人工接种法和离体叶片接种法3 种［30］。（1）田间自然发病鉴定法：许多研究认为田间自然发病鉴定法是一种有效方法，但田间鉴定需要大量土地，环境条件不可控，每年只能鉴定1 次，受时间、环境影响，鉴定效率较低，因此不常用。苏银铃等［31］对41 份番茄进行田间检测3 种叶部病害，发现晚疫病发病最轻。刘梦姣等［32］利用田间鉴定和分子标记相结合的方法对广西樱桃番茄抗晚疫病进行鉴定，26 份樱桃番茄材料对晚疫病表现出不同程度抗性，其中表现免疫的7 份、高抗的15 份、中抗的4 份。

（2）苗期人工接种法：在番茄4～6 片真叶期，用喷雾法接种晚疫病原菌孢子囊悬浮液，浓度为1.2×103～5×104个孢子囊/mL，接种后6～8 d 调查植株发病情况，分级标准采用5 级或6 级，该方法被证实与田间自然选择有高度一致性［33-34］。程沄等［35］比较了喷雾法在苗期和成株期接种后的差异，发现苗期和成株期的抗病性基本一致。苗期接种法作为鉴定晚疫病的有效方法被研究者广泛采用。毛爱军等［36］采用苗期喷雾法对7 份杂交一代番茄品种和10 份自交系进行鉴定，发现7 份杂交一代品种高感，10 份自交系材料中有7 份高感、3 份耐病。智晓娜等［37］采用喷雾接种法对182 份野生种醋栗番茄进行筛选鉴定，有25份对T0.1 小种表现出稳定的抗性，其中免疫1 份，高抗5 份，中抗19 份；对T1.2 小种表现出抗性的种质资源22 份，占12.09%，其中高抗种质3 份，中抗种质19 份。

（3）离体叶片接种法;与马铃薯离体接种法相似，采用6～7 叶期叶片，接种病原菌悬浮液于叶片背面主叶脉的两侧，接种浓度为1×103～5×104个孢子/mL，每叶片接种量为30 μL。张文淑等［38］利用幼苗期和成株期离体叶片喷雾法，鉴定了680 份番茄材料，未发现免疫型。张喜春等［39］采用叶片离体接种法对俄罗斯6 个番茄品种进行鉴定，结果表明番茄晚疫病最适的孢子囊悬浮液接种浓度为1×103个孢子囊/mL,最佳调查时间为接种后3～5 d。姜晓艳等［40］对番茄晚疫病人工接种技术进行了系统研究，采用孢子囊悬浮液喷雾法和离体叶片涂抹法对20 份番茄材料进行了抗病性鉴定，筛选出6 份抗病、3 份高抗材料，证实喷雾法和离体叶片涂抹法的鉴定结果基本一致。

1.3 辣椒疫病抗性鉴定

辣椒疫病由Phytophthora capsiciL.疫霉菌引起，首次由Leonian 于1922 年在新墨西哥州发现，抗性鉴定方法有：（1）灌根法：在苗龄5～7 叶期，植株根部接种孢子悬浮液1×104个孢子/mL，接种6 d 后调查发病情况，采用5 级分级标准统计病情。（2）离体叶片法：始花期的健康叶片接种2×104～3×104个孢子/mL 孢子悬浮液或者菌饼块（病原菌在胡萝卜培养基培养5 d 后，用打孔器打出菌饼），以接种叶平均病级作为鉴定效果分析和抗性分级的指标。（3）伤茎法：在植株根部用手术刀或者牙签将根部划伤，再灌根接种。（4）茎叶喷雾法：采用苗期喷孢子悬浮液的方法。其中灌根法与田间发病情况最相似而被广泛应用。吴丽萍等［41］采用灌根法对19 个辣椒资源进行鉴定，发现高抗材料19 个、抗病材料5 个。蓬桂华等［42］采用灌根法对30 份贵州辣椒品种进行鉴定，发现抗病材料1 份，中抗、中感及感病材料各9 份，高感2 份，周洋等［43-44］均采用灌根法对辣椒资源进行鉴定筛选。方文慧等［45］比较了灌根法、菌悬液接种叶片法及茎部贴菌法鉴定辣椒抗性，认为灌根法更加快捷、准确、方便且与病圃发病结果相似。易图永等［46］比较了离体叶片接种法、切茎接种法及灌根接种法的优缺点，发现3 种方法均能区分辣椒品种的抗感性，可根据需要选择适宜的接种方法。但Kim 等［47］研究得出，对于致病力较弱的菌株，叶部喷雾法和伤茎法比灌根法更好。李智军等［48］利用菌悬液接种离体叶片的方法鉴定辣椒，发现离体叶片接种法与灌根法和喷雾法两种方法的吻合度分别为68.4%、76.3%。赫卫等［49］建立了浸根法鉴定辣椒疫病的抗性，即在苗龄为5～6 片真叶期时采用浸根法接种，接种游动孢子悬浮液浓度为10 个孢子/mL，接种5 d 后调查发病率和病情指数，即可对辣椒品种进行抗性水平分级鉴定。

辣椒疫病抗性鉴定方法较多，辣椒疫病菌株也有小种分化现象，在方法选取时要考虑选取有代表性的菌株、接种苗龄、接种部位及环境条件的影响。

2 瓜类蔬菜疫病抗性鉴定方法

瓜类疫病的瓜类疫霉（Phytophthora melonisKatsura）可侵染黄瓜、冬瓜、节瓜、南瓜等瓜类作物。而西瓜和部分地区南瓜的疫病由Phytophthora capsiciL.引起。瓜类疫病是一种毁灭性病害，给瓜类生产造成巨大损失。由于缺乏抗源，相对于茄果类蔬菜抗性鉴定研究，瓜类的抗性鉴定方法研究较少。

2.1 黄瓜

20 世纪80 年代，国内学者开始瓜类疫病抗性鉴定的研究。翁祖信等［50］提出菌丝块活体接种黄瓜幼苗的方法，即子叶展平期在子叶中央点一滴无菌水，将培养皿菌丝打孔，获得0.2 cm 菌丝块，将其放入水滴中，保湿24 h，3 d 后调查发病情况。1983 年又提出用孢子悬浮液接种活体黄瓜幼苗，在一片真叶期接种，在一片子叶和真叶中央接种孢子悬浮液50 μL，浓度为100 个孢子/mL，结果显示接种子叶和真叶期抗病性表现基本一致［51］。2010 年黄瓜抗疫病鉴定技术规程则采用灌根法：在植株2～3 片真叶期，在根部附近接种2 mL 浓度为5×103个孢子/mL 的孢子悬浮液。接种后7～10 d 采用5 级病情分级法，进行抗性评价。柴喜荣等［52］利用灌根法对7 个不同黄瓜品种进行疫病的抗病性筛选，其中长春密刺、正源油绿花青大吊瓜、抗病二号和粤秀3 号为中抗品种；中农20 号、早青二号和津优1 号为感病品种。王瑞等［53］利用菌块离体接种法对40 份不同抗性的黄瓜材料进行鉴定，发现栽培黄瓜抗疫病材料极少，只有PE40、PE119、PE120、PE185等4 份材料具有抗性，90%材料为感病或高感。

2.2 南瓜

刘学敏等［54］研究了接种体和接种部位对南瓜疫病接种效果的影响，结果显示，接种游动孢子浓度为5×103～1×104个孢子/mL，接种部位为叶柄时发病最快。周克琴等［55］比较灌根法、注入法、根部切伤法发现，最优组合即在3片真叶期，利用注射法接种3 mL（1 250 个孢子/mL），保湿时间48 h，接种后72 h 调查，该方法鉴定结果与多年田间鉴定结果一致。陆杰等［56］采用根部接种和叶片接种相结合的方法，对112 份种质资源进行室内疫病抗性鉴定及评价，筛选获得了高抗材料2 份，抗病材料3 份，中抗材料9 份，其余均为感病材料。

2.3 西瓜、冬瓜

王永琦等［57］在西瓜疫病鉴定法研究中对比了灌根法、注射法和喷雾法，发现注射法发病最快、发病率高，不宜做抗性鉴定；喷雾法鉴定抗病性与田间不符，而灌根法最能反映田间发病过程，能够有效区分各品种抗性，确定接种浓度1×106个孢子/mL、接种时期为2 片真叶期、调查时间为接种后12～15 d 为宜。曾莉莎等［58］将灌根法与离体叶片接种法进行比较，明确了成株期离体叶片接种法鉴定冬瓜疫病抗性是可行的，并采用离体叶片接种法对23 份冬瓜品种和18 份节瓜品种进行抗病性鉴定,从中筛选了抗、耐疫病的冬瓜和节瓜品种。

瓜类疫霉菌相对其他疫霉菌难以诱导大量孢子囊，游动孢子不足难以满足大批量材料鉴定需求，且游动孢子在水中游动非常快，难以计算准确。基于此笔者所在团队建立了一套高效简便的子叶离体接种方法［53］，能够有效鉴定黄瓜资源的疫病抗性情况。即利用2 mm 直径菌块直接接种于离体子叶背面，置于有润湿滤纸的培养皿中，保湿24 h 即可观察表型，通过计算病斑大小快速鉴定瓜类材料的抗性。该方法具有简单、快速、精准、高通量的特点，且适用性广，能在多种瓜类作物上使用［53］。

3 芋头疫病抗性鉴定

芋头疫病是由Phytophthora colocasiae引起的最重要的芋头病害之一。我国广东地区芋头栽培面积逐年扩大，芋头疫病的发生也越来越严重，极大影响芋头产业发展［59］。芋头疫病抗性鉴定起初依靠田间自然发病，但田间鉴定除依赖于合适的发病环境条件外，还需充足的田块，费时费力。为解决这些问题，研究者建立了实验室快速检测技术，但由于芋头叶片具有疏水特性，活体检测很难保证菌液停留在叶片上，为此Books等［60］建立了芋头离体叶片鉴定疫病抗性鉴定技术，即取第2 嫩或第3 嫩的叶片，在搪瓷盘放2 层沙布，加适量灭菌水，将叶片平铺于搪瓷盘中，在叶片上选4 个点，其中3 个点各滴20 μL 孢子悬浮液，每滴含50 个孢子，另一个点滴20 μL 灭菌水作对照。点样后用塑料薄膜盖住搪瓷盘保湿，于28℃光照培养箱中培养，4 d 后测量病斑的直径来评判植株抗性。后期芋头疫病检测大都采用该方法或少许改进。周清平等［61］采用Books 方法对39 个芋头品种（品系）进行鉴定发现，8 个表现抗性，11 个表现中抗，20 个表现感病。莫俊杰等［62］在Books 方法上进行改进，即利用0.5 cm 菌块接种离体叶片，效率更高，并对63 个芋头品系进行鉴定，其中6 个表现抗病，9 个表现中抗，42 个表现感病，其余抗性不明确。

4 存在问题

4.1 抗性鉴定研究薄弱，缺乏系统性研究

长期以来，由于抗性研究材料限制，导致蔬菜疫病抗性鉴定研究较薄弱。除对茄果类马铃薯研究较深入外，其他蔬菜作物疫病抗性研究均缺乏系统性。从已有研究方法来看，不同地区对同一作物采用的鉴定方法都不同，主要表现在接种浓度、接种菌株、接种苗龄及接种部位。如马铃薯晚疫病菌存在A1、A2 两种交配型，生理小种有几十个［63］，辣椒疫病致病菌主要有3 个生理小种。不同地区不同优势菌株，即使是同样菌株的致病力也存在差异，抗性鉴定时要考虑菌株的致病力，选用代表性菌株或者当地致病力强的菌株。对于接种苗龄，就目前已经发表的抗性鉴定方法看，同种作物研究者采用的苗龄也不相同，有的采用子叶期、幼苗期或者成株期，不同苗龄的抗性不同，鉴定结果也存在差异，因此相同资源用不同方法的鉴定结果也会存在差异。

4.2 评价标准不同，鉴定结果存在差异

虽然，马铃薯、番茄、黄瓜等在疫病鉴定方面都建立了鉴定技术规程，但实际工作中研究者仍采用不同的评价标准对其进行抗性鉴定。以番茄苗期抗性鉴定评价标准为例，行业标准采用0～6 级病情分级，抗性评价标准为5 级分别为免疫、高抗、抗病、中抗、感病、高感。苏银铃等［31］采用0～9 级分级标准，抗病程度为高抗、抗病、中抗、感病、高感。刘梦娇等［32］采用0～6 级分级标准，但是病斑面积与行业标准描述病斑面积差异明显。无论是病情描述还是抗性分类都存在较大差异。评价标准的差异直接反映鉴定结果，因此研究者在开展鉴定工作时需要选择合适的方法和评价标准，才能确定种质资源的真实抗性水平。采用统一的鉴定标准对于抗病育种工作尤为重要，只有利用统一的抗性评价体系才能充分了解不同种质资源的真实抗性水平，才能被育种工作者充分合理利用。

4.3 离体鉴定技术缺乏农业行业标准

离体鉴定方法在蔬菜疫病抗性鉴定工作发挥重要作用，其操作方便，可以保存鉴定植株，特别在病原菌与植物互作研究中被广大研究者青睐。目前，仅有马铃薯建立了离体叶片鉴定技术规程行业标准［63］，其他作物均未建立离体叶片的鉴定技术标准。

5 展望

抗性鉴定工作是抗病育种过程中的重要环节和手段之一。目前，蔬菜疫病抗性鉴定工作已取得较大进步，但总体上还不够完善，如不同鉴定方法的可比性、苗期和成株期抗性的相关性、苗期鉴定相关因素的综合评价与分析等方面仍需要进一步研究、探讨和完善。因此，针对不同蔬菜作物疫病的抗性鉴定工作，可以成立区域或者全国联合攻关小组，对各因素进行全面系统研究，建立统一、规范的鉴定技术与评价体系。另外，加强蔬菜疫病分子生物学研究，开发有效的分子标记，利用分子辅助筛选与抗性鉴定技术相结合的抗性筛选技术和鉴定体系是抗性鉴定发展的方向。蔬菜疫病抗性鉴定技术是蔬菜疫病抗性育种的前提与保障，能够加速蔬菜抗疫病育种进程，促进我国蔬菜产业长足发展。