INRA717-1B4杂交杨TAC基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建及编辑效率检测

郝璞，薄高峰，刘璐，白鹤鸣，吴凤霞，周星雨，杨海峰

（内蒙古农业大学林学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

CRISPR/Cas9系统作为近年来被广泛开发应用的基因编辑工具，主要由核酸内切酶Cas9和一个单分子向导RNA（single guide RNA，sgRNA）组成，通过RNA与目标DNA的互补配对，Cas9蛋白在目标序列进行特异切割，造成DNA双链断裂，通过激活细胞自身修复机制——非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）来实现基因敲除、插入以及染色体重组等，最终导致随机突变的产生［1］。CRISPR/Cas9系统最早应用于动物和微生物中，后证实在水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、烟草（Nicotiana benthamiana）、高粱（Sorghum bicolor）、玉米（Zea mays）等植物中也能实现定点编辑［2-8］；之后宋时奎等［9］整理了CRISPR/Cas9系统在单子叶和双子叶植物中基因组定点编辑的案例，得出该系统在植物基因组进行定点编辑的可行性，特别是由于嵌合sgRNA的成功设计，使其应用更加简单方便。此后CRISPR/Cas9被应用于各个领域，在动植物基因功能验证、农作物性状改良以及人类疾病治疗方面展现出了巨大的发展前景［10，11］。CRISPR/Cas9系统的出现是分子育种学上革命性的技术突破，也是现代基因组学靶向修饰工作的巨大进步［12］。

INRA717-1B4杂交杨（Populus tremula L.×P.alba L.），属白杨派落叶乔木，具有基因组小、实验特性优良、易转化、生长繁殖迅速等特点［13］。作为木本植物的模式物种，CRISPR/Cas9系统在杨树中实现了广泛应用。Fan等［14］利用CRISPR/Cas9系统完成了杨树内源基因定点突变，成功敲除毛白杨（P.tomentosa Carr.）PDS基因（phytoene desaturase gene），导致杨树叶片白化。Zhou等［15］利用CRISPR/Cas9技术成功编辑717-1B4杨的4CL1和4CL2基因（4-coumarate：CoA ligase gene）。Bruegmann等［16］针对717-1B4杨选取了12个基因，包括调控开花时间基因SOC1、FUL及其同源基因、4个NFP基因和TOZ19基因，转化获得15个抗性株系，经PCR鉴定均为阳性植株。本研究利用CRSPR/Cas9系统对TAC基因进行敲除，以期为TAC在717-1B4杨的基因功能验证提供研究依据，并为其他作物TAC同源基因的功能验证提供材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

INRA717-1B4杂交杨（Populus tremula L.×P.alba L.，简称717-1B4杨），取自内蒙古农业大学林学院教研室；717-1B4杨全基因组数据信息源于717-1B4杨基因组数据库（aspendb.uga.edu/databases/spta-717-genome）；入 门 载体pEn-Chimera、表达载体pDE-CAS9-NPTⅡ，均由美国农业部林务局西南太平洋工作站林木遗传所赠送；大肠杆菌DH5α感受态细胞、DB3.1感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；农杆菌GV3101感受态细胞，购自北京博迈德生物技术有限公司。

1.2 入门载体的构建

1.2.1 717-1B4杨TAC基因靶位点序列的设计 CRISPR/Cas9系统的切割过程主要凭借核糖核蛋白复合物crRNA和Cas蛋白，扫描外源序列的protospacer以及PAM，PAM序列不显现在靶点序列里。选择靶点时要尽量保证其特异性，从而降低脱靶概率。靶点要求长度为20 bp，靶位点特异性高，不要出现连续多个A或者T，3′端要有PAM序列，引物不显示PAM序列。在717-1B4杨中TAC基因的第一个旁系同源基因（Potri.002G175300）和第二个旁系同源基因（Potri.014G102600）筛选外显子序列，评估靶点的脱靶效应及GC含量，GC含量保证在40%～70%之间，设计两个靶位点sgRNA，分别命名为pDe-TAC1-1和pDe-TAC2-1。利用717-1B4杨基因组数据库及推荐的靶位点（spta717grnas.csv）结合毛果杨等相关基因组进行靶点比对，确保靶点的特异性。根据靶点合成相应引物（表1），由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成，纯化级别为PAGE。

表1 本研究所用引物

1.2.2 pEn-Chimera入门载体的构建及转化利用限制性内切酶BbsⅠ将pEn-Chimera载体质粒进行酶切，酶切体系（20μL）：pEn-Chimera 10μL、10×NEB buffer 2μL、NEB BbsⅠ1μL、ddH2O 7μL。37℃孵育1 h，孵育后的产物70℃反应15 min，使BbsⅠ失活。线性化后采用1%琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，使用试剂盒（EasyPure®Quick Gel Extraction Kit）对产物进行胶回收，得到线性化pEn-Chimera入门载体。取上下游靶位点引物TAC1-1-F/R或TAC2-1-F/R各2 μL、ddH2O 46μL于离心管中混匀，95℃处理5 min后取出，室温冷却20 min，制备靶点互补双链。取pEn-Chimera入门载体2μL、互补带有靶点序列的产物3μL、T4连接酶1μL、T4 Buffer 5μL于200μL PCR管中混匀，25℃反应1 h，之后65℃反应15 min，进行载体与靶点序列T4酶的连接反应，最后采用电击法进行DH5α感受态转化，并过夜培养。挑选单菌落，以M13F为上游引物、TAC1-1-R或TAC2-1-R为下游引物，上下游引物各1μL，Premix rTaq 10μL，ddH2O 8 μL，进行序列扩增。扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选阳性菌落，测序。

1.3 表达载体的构建

取pEn-Chimera入门载体2μL、pDE-CAS9-NPTⅡ表达载体3μL、TE buffer 4μL、LR clonaseⅡ1μL于PCR管中，25℃反应6 h，构建LR反应。取50μL DH5α感受态细胞，加入LR反应产物，混匀，冰浴30 min，42℃热激45 s，再次冰浴2 min，加入500μL无菌LB培养基，37℃、200 r/min培养1 h，实现感受态细胞的转化。将已转化的感受态细胞在LB固体培养基上均匀涂开，37℃过夜培养。以TAC1-1-F或TAC2-1-F为上游引物、SS102为下游引物，上下游引物各1 μL，Premix rTaq 10μL，ddH2O 8μL，进行PCR扩增。扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，阳性菌落进行测序。

1.4 农杆菌的转化

取农杆菌感受态细胞100μL加入0.01～1.00μg表达载体质粒，混匀，冰上静置5 min，液氮冷冻5 min，37℃水浴5 min，冰浴5 min，加入700μL LB液体培养基，28℃培养2～3 h。6 000r/min离心1 min，取100μL上清重悬菌块，在LB固体培养基上均匀涂开，28℃倒置培养2～3 d。取SS61和靶点反向序列TAC1-1-R或TAC2-1-R各1μL，Premix rTaq 10μL，ddH2O 8μL于PCR管中混匀，使用枪头蘸取单菌落于离心管中，PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃恒温保存。1%琼脂糖凝胶电泳进行农杆菌转化检测。

1.5 717-1B4杨的转化

利用叶盘法进行717-1B4杨的转化。①预培养：取生长良好、无病害的717-1B4杨组培苗自上而下第三片到第五片叶，使用打孔器沿叶脉方向进行打孔取材，置于CIM愈伤诱导（无抗生素）培养基中28℃暗培养。②菌种活化与培养：取农杆菌于含Rif和Spec的LB培养基上进行划线，28℃倒置培养，筛选单菌落进行摇菌活化，180 r/min、28℃暗培养至OD600为0.3～0.5。③侵染：将培养好的菌液进行离心，重悬，重悬OD600值为0.3～0.5，振荡侵染叶片10 min，50～100 r/min离心，过滤菌体，取出叶片。④共培养：将叶片于CIM愈伤诱导培养基（无抗生素）上，28℃暗培养2～3 d，直至叶片背面出现环形菌斑，但无大面积形成。⑤选择培养：取出共培养的叶片，ddH2O洗涤3次，每次5 min，清洗液洗涤1次，转移至抗Kana的CIM愈伤诱导培养基中，28℃暗培养2周后，更换新的抗Kana的CIM愈伤诱导培养基，转为28℃光下培养1周，促进愈伤的形成。⑥使用Kana抗性的SIM芽诱导培养基进行不定芽诱导，直到不定芽生长至1～2 cm，切下置于Kana抗性SEM芽伸长培养基组培瓶中进行光下伸长培养，直到获得抗性植株。

1.6 转基因植株鉴定

使用CTAB法提取转基因植株幼嫩叶片DNA，以序列TAC1-1-F或TAC2-1-F为上游引物、SS102为下游引物，PCR扩增体系（20 μL）：上、下游引物各1μL、DNA 1μL、2×Easy Taq PCR Super Mix 10μL、ddH2O 7μL。PCR扩增程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃恒温保存，取10μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选阳性植株。

1.7 T4载体连接及测序

以转基因植株DNA为模板，使用引物TLZF和TLZ-R进行PCR扩增。扩增体系（20μL）：上、下游引物TLZ-F、TLZ-R各1μL，模板DNA 1μL，2×Easy Taq PCR Super Mix 10μL，ddH2O 7μL。扩增程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。4℃恒温保存。PCR扩增产物纯化后与pMD19-T载体连接，取5μL连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，在AMP抗性的LB培养基上37℃培养12～16 h，挑选完整、圆润的20个单菌落进行菌落检测，取阳性菌斑进行活化、测序，利用DNAMAN（Version 7.0）对测序结果与靶点序列进行比对，计算编辑效率。

2 结果与分析

2.1 TAC基因的靶点设计

利用717-1B4杨基因组数据库及推荐的靶位点，结合已知的水稻、拟南芥基因序列，将717-1B4杨和毛果杨基因组序列进行对比，在毛果杨中确定2个TAC同源基因Potri.002G175300、Potri.014G102600，将其与717-1B4杨中的2个TAC同源基因进行比对，序列相似度分别高达97.65%和98.01%（图1）。表明717-1B4杨TAC基因组序列为TAC-like基因的旁系同源基因。根据基因编辑靶点设计原则，设计了717-1B4杨中2个TAC同源基因的2个单基因编辑靶点，其中第一个同源基因的基因编辑位点位于外显子第323个核苷酸处，第二个同源基因的基因编辑位点位于外显子第58个核苷酸处。靶点均位于基因的前中端。

图1 TAC基因家族系统进化树

2.2 TAC基因的入门载体构建

电泳检测结果（图2）表明，目标条带约369 bp，与预期目标片段一致。经测序比对，TAC1-1、TAC2-1基因靶点已成功进入pEn-Chimera载体，表明TAC1-1、TAC2-1入门载体连接成功。

图2 入门载体的PCR鉴定

2.3 TAC基因的表达载体构建

将携带靶点序列的入门载体pEn-Chimera通过同源置换反应构建pDE-CAS9-NPTⅡ表达载体。电泳检测结果（图3）表明，目标条带约933 bp，与预期目标片段一致，且无明显非特异性扩增。经测序分析，TAC1-1、TAC2-1入门载体已成功置换pDE-CAS9-NPTⅡ表达载体中，表明pDE-CAS9-NPTⅡ：：TAC1-1、pDE-CAS9-NPTⅡ：：TAC2-1表达载体构建成功。

图3 表达载体的PCR鉴定

2.4 转基因植株的获得

将构建成功的基因编辑载体pDE-CAS9-NPTⅡ：：TAC1-1、pDE-CAS9-NPTⅡ：：TAC2-1通过农杆菌介导法转化717-1B4杨。经外植体叶片预培养、抗性愈伤诱导培养、抗性芽的分化和伸长培养、生根与增殖培养，pDE-CAS9-NPTⅡ：：TAC2-1载体成功获得抗性苗（图4）。

图4 转基因植株获得过程

2.5 转基因植株的PCR鉴定

对获得的20株抗性苗进行鉴定，以携带靶点的质粒为阳性对照，野生型717-1B4杨为阴性对照，进行PCR检测。检测结果（图5）表明，1、2、4、6、8、11、12、15、16、18、19、20号共12个株系检测为阳性，PCR阳性鉴定转化率为60%。

图5 转基因阳性苗鉴定

2.6 转基因植株靶点序列突变分析

在获得的12株转基因植株中，基因靶标序列位点在8号、15号株系中均发生碱基缺失，其中8号株系靶点的第11、12个碱基发生缺失，15号株系靶点的第5～9个碱基发生缺失，靶点编辑效率16.7%，均为杂合突变体。其余株系均如株系1、2、4号未发生基因缺失或插入（图6）。

图6 靶点基因突变类型

3 讨论

TAC基因作为IGT基因家族的一员，主要参与植物地上部的分枝角度以及侧枝生长方向的调控。在水稻、玉米、桃树、拟南芥等植物中，TAC1通过调控枝条的向地性，影响植物的分枝角度［17］；在水稻中，TAC2突变体表型与TAC1接近。因此，本试验以TAC基因为例设计了两个基因靶点，构建入门载体和表达载体，通过农杆菌介导法转化717-1B4杨，利用CRISPR/Cas9系统获得抗性植株，并对抗性植株进行鉴定、靶点编辑检测及靶点编辑效率分析，旨在为后续717-1B4杨IGT基因家族TAC基因功能的研究提供数据参考。

CRISPR/Cas9系统作为新兴基因编辑技术，具有广泛的应用前景，仅需设计1～2个目标靶向序列就可以引导Cas9蛋白对目的基因进行特异性的结合修饰，最终导致基因突变或敲除，极大地推动了基因基础研究的发展［18］。研究显示，利用CRISPR/Cas9技术编辑植物基因组DNA，产生的突变类型多为碱基缺失和插入，且碱基缺失突变频率远高于碱基插入突变频率［19，20］。本试验利用CRISPR/Cas9技术进行编辑，从阳性植株中筛选获得2株杂合突变体，且均为碱基缺失，基因编辑效率16.7%，说明717-1B4杨TAC基因产生的碱基缺失突变频率较高，与前人研究结论一致。

本研究构建的两个表达载体为单靶点基因编辑载体，TAC基因的靶位点符合设计要求，GC碱基含量为40%，但靶位点编辑效率较低。有研究指出，通常情况下单个sgRNA只能靶向1个基因位点，编辑效率低且不稳定，而多个sgRNA靶向同一基因的不同位点，不仅可以提高基因编辑频率，还可能造成大片段的碱基突变［21］。胡春华等［22］利用改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统，以香蕉MaPDS基因为例，成功实现了对香蕉内源基因的定点敲除，获得白化突变体株系。汪秉琨等［23］构建了Wx基因双靶点CRISPR/Cas9表达载体，也获得多个位点突变的个体。CRISPR/Cas9系统在植物中的编辑效率受其他多种因素的影响，如Cas9蛋白活性［24］、靶标数量、sgRNA启动子［25］、靶点序列GC含量［26］及载体的sgRNA表达量［27］等，甚至还会出现脱靶情况［28］。Slaymaker等［29］对Cas9蛋白结构进行了完善，提高了表达载体的突变效率，减少了脱靶情况。Ma等［30］在水稻研究中发现靶位点序列的GC含量较高（50%～70%）时编辑效率相对更高。Dang等［31］在原有sgRNA长度的基础上增加了10个碱基，完善了sgRNA骨架序列，结果表明完善后的基因编辑效率提高约50%。Fu等［32］探讨了突变效率与sgRNA长度的关系，发现其自身活性不受影响的前提下，控制sgRNA长度在17～18 nt可以明显降低脱靶效应。以本试验结果为基础，在运用CRISPR/Cas9系统对物种进行编辑时，可以尝试对该物种所用的sgRNA长度、Cas9载体、GC含量、蛋白结构等进行优化，从而获得更高的编辑效率。

本试验pDE-CAS9-NPTⅡ：：TAC2-1载体成功获得抗性苗，pDE-CAS9-NPTⅡ：：TAC1-1载体未获得抗性苗，植株遗传转化的方法、品种等因素可能是原因之一；717-1B4杨作为试验材料，在遗传转化预培养浸染时发现植株外植体容易发生褐化死亡、农杆菌过度污染导致死亡等问题，对抗性植株的获得造成了极大阻碍，在参考刘闵豪［33］、苏文龙［34］等对预培养时间、菌液侵染浓度以及农杆菌侵染时间等一系列优化调整后，农杆菌过度污染等问题得到缓解。本试验基于CRISPR/Cas9技术，成功构建了717-1B4杨TAC基因敲除表达载体，并获得了基因突变植株，后续将移入土中继续进行观察与分析，为深入研究TAC基因的生物学功能及分子机制提供良好的数据参考。

4 结论

本研究利用717-1B4杨基因组数据构建了TAC基因敲除表达载体，并对717-1B4杨进行了遗传转化，共获得12个株系抗性苗，基因编辑效率为16.7%，为CRISPR/Cas9技术在717-1B4杨中的应用做了初步探索，同时为TAC基因功能的研究和分子育种提供理论依据。