食线虫真菌防治植物寄生线虫研究进展

郝 昕，王博文，陈 洁，李 洋，马 玲

(东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

植物寄生线虫隶属于线性动物门(Aschelminthes)线虫纲(Nematoda)，主要营寄生生活。经统计，每年由植物寄生线虫所造成的损失平均高达1 570亿美元，严重制约世界各国农林业的发展[1]。一直以来对植物寄生线虫的防治以化学杀线剂为主，但化学杀线剂毒性大、对环境危害严重，且近年来随着经济水平的不断提高以及我国对生态文明的大力建设，利用生物防治技术对植物寄生线虫进行防治日益受到科研人员的关注[2]。利用食线虫真菌防治线虫是目前已知最安全稳定的生物防治线虫的方法，食线虫真菌可以寄生并杀死多种线虫，具有极强的宿主专一性和依赖性，充分利用食线虫真菌是防治线虫的重要方法。因此，了解食线虫真菌与线虫之间相互作用关系及其调控机制、制定相关生物防治策略，是保护农林作物免受线虫危害的关键环节。同时，部分食线虫真菌在感染线虫时还能合成并分泌多种具有杀线虫活性的次级代谢产物，在线虫的绿色防控中具有广泛的应用前景和生态价值。

食线虫真菌是指一类通过捕捉、寄生、定殖毒杀线虫的微生物，是自然界控制线虫数量的主要生物因子。近年来，随着植物寄生线虫如松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)、孢囊线虫(Heteroderaglycines)、根结线虫(Meloidogyneincognita)大面积大范围的暴发，以及人们环境保护意识的不断提高，食线虫真菌凭借无环境污染、对人畜无害、持效期长等优点成为研究人员关注的焦点。研究发现，在温室和野外施用伊氏线虫菌(Esteyavermicola)能显著降低松材线虫对松树的侵染[3]；淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)对烟草根结线虫的防控具有极佳的效果[4]；镰孢菌属(Fusarium)对大豆和燕麦孢囊线虫均具有显著的防治效果[5-6]。鉴于此，从目前已知食线虫真菌分类、作用机制、防控效果影响因素和应用现状等方面进行总结和归纳，阐述食线虫真菌与线虫宿主间未来的发展方向，为精准线虫靶标生防制剂的开发和利用提供借鉴和参考。

1 食线虫真菌分类

食线虫真菌是在食物来源有限的情况下将线虫作为营养来源的一类特殊微生物，根据侵染线虫的方式将其分为捕食线虫真菌(Nematode-trapping fungi)、内寄生真菌(Endoparasitic fungi)、产毒真菌(Toxic fungi)和机会真菌(Opportunistic fungi)四大类[7]。全世界已报道的食线虫真菌达700余种，其中包括捕食线虫真菌380余种、线虫内寄生真菌120余种、产毒真菌270余种及大量机会真菌[8]。

1.1 捕食线虫真菌

捕食线虫真菌是指以营养菌丝特化形成的黏性球、黏性网、收缩菌环和非收缩菌环等捕食器官捕捉线虫的真菌。捕食线虫真菌的捕食器由营养菌丝分化而形成，捕食器的类型受真菌的种类以及生物和非生物环境条件的影响[9]。捕食性真菌均具有近似的生物学特性，即在特殊环境条件下由营养菌丝特化形成捕食器官以捕获线虫或直接从分生孢子上生长出来，类型主要有上述提到的黏性菌丝、黏性网、黏性球、收缩性菌环、非收缩性菌环等[10]。捕食线虫真菌中的代表菌种包括形成收缩菌环的节丛孢属(Arthrobotrys)、产生收缩菌环的单顶孢属(Monacrosporium)和既形成收缩性菌环又形成黏性捕虫器官的小掘氏孢属(Dactylella)真菌等[11]。

1.2 线虫内寄生真菌

线虫内寄生真菌是指通过特殊孢子寄生于活跃线虫体内的一类真菌。目前，已报道的食线虫真菌中内寄生菌物主要分布于真菌界的卵菌门(Oomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)、子囊菌门(Ascomycota)、半知菌门(Deuteromycota)及担子菌门(Basidiomycota)[12]。根据侵染线虫的真菌孢子不同，线虫内寄生真菌分为成囊孢子菌物(Encysting spore)、黏性孢子菌物(Adhesive spores)、吞噬孢子菌物(Ingested spores)和注射孢子菌物(Injection spores)[13]。线虫内寄生菌物可以侵染线虫的各个生长发育阶段，主要通过分泌产生胞外酶消解线虫表皮并侵入线虫体内[14]。

1.3 产毒真菌

产毒真菌是指那些能够通过分泌毒素或某些裂解酶类物质杀死或抑制线虫的真菌。目前，已报道的食线虫真菌中产毒菌物主要分布于真菌界的担子菌门层菌纲(Hymenomycetes),子囊菌门盘菌纲(Discomycetes)、腔菌纲(Loculoascomycetes)、核菌纲(Pyrenomycetes)、不整囊菌纲(Plectomycetes),半知菌门丝孢菌纲(Hyphomycetes)、腔孢纲(Loculoascomycetes)[15]。产毒菌物主要通过微生物代谢产物实现抑制或杀死线虫，具有杀线虫活性的微生物代谢产物有近百种之多，不仅包括乙酸等简单的小分子化合物，也包括蛋白质等多种高分子化合物，还包括醌类、生物碱类、萜类、内脂类、多肽类、吡喃类、呋喃类、有机酸类、萘类等。其中，常见的有机酸类主要有亚油酸、反癸烯二酸、乙酸等[16]，内酯类化合物有茎点霉内脂、阿维菌素和布雷菲德菌素等，多肽类化合物有环缩肽和一些蛋白质晶体[17]。

1.4 机会真菌

线虫机会真菌又称线虫条件致病真菌，是指一类寄生于线虫的雌虫、卵及定殖线虫胞囊和卵囊上的菌物，主要为土壤真菌。根据寄生物的复杂程度，分为专性寄生物如辅助链枝菌(Catenariaauxiliaris)、嗜雌线生菌(Nematophthoragynophila)和兼性寄生物如厚垣孢轮枝霉(Verticilliumchlamydosporium)、淡紫拟青霉(P.lilacinus)及D.oviparasitica。机会真菌并不显著地寄生于线虫上，而是平常寄生在宿主植物上作为植物病原菌，只有在合适的时候才会转而定殖于线虫胞囊或卵囊等繁殖体上并利用虫体内的营养物质生长，同时产生多种酶抑制卵的孵化[18]。

2 食线虫真菌作用机制

2.1 捕食线虫真菌

捕食线虫真菌的整个捕食过程主要分为4个阶段：捕食器官形成阶段、捕捉线虫阶段、侵入虫体阶段和作用线虫阶段。捕食线虫真菌通过线虫触碰菌丝分枝、弯曲折叠融合形成捕食器官。首先在营养菌丝体的某一段先产生一个小突起，突起生长延伸形成菌丝并与原生菌丝体融合形成三维菌网的第1个菌环，该菌环再次产生突起形成第2个菌环，多个菌环相互融合形成复杂的三维菌网，三维菌网的每个环内外均具有黏性物质，因此菌网具有黏性三维立体结构[19]。另外一种十分常见的捕食器官黏性球是由位于菌丝上或顶点处的1～3个细胞组成的球状或近球状的黏性细胞[20]。这2种捕食器官的表面都覆有黏性物质以便捕获线虫。虽然捕食线虫器官形态多样，但是分子系统发育分析表明，大部分捕食线虫真菌属于子囊菌门。不仅如此，研究表明捕食线虫真菌的捕食器官主要向2个方向进行发展：一个是产生收缩环，另一个是形成三维菌网、黏性球和黏性分枝等黏性捕虫器官[21]。三维菌网形成后，当线虫经过或触碰到捕食器官时，就会被上述黏性捕食器官粘住，随着线虫的不断蠕动使线虫的其他部位也被捕食器官粘住[22]。当线虫被捕食器官捕获后，捕食器官迅速膨胀并形成侵入钉穿透线虫体壁侵入线虫体内，菌丝进入虫体并在线虫体内生长发育，吸收线虫体内的营养物质，逐渐消化分解线虫[23]。

2.2 线虫内寄生真菌

线虫内寄生真菌主要通过成囊孢子、黏性孢子、吞食孢子和注射孢子对线虫进行由体外到体内、再由体内到体外的侵染[24]。随着孢子种类的不同，线虫内寄生真菌侵染线虫方式也体现出不同的侵染方式。链枝菌属(Catenaria)和串胞壶菌属(Myzocytium)的许多种都能产生孢囊孢子，孢囊孢子侵染线虫成虫主要通过游动孢子囊产生有鞭毛的游动孢子，遇到线虫后鞭毛脱落，在线虫的口腔或体壁处通过产生芽管侵入线虫体内，在线虫体内形成游动孢子囊，孢子成熟后通过孢子囊萌发形成的溢出管释放出虫体[25]。而半知菌掘氏梅里霉属(Drechmeria)、被毛孢属(Hirsutella)、轮枝孢属(Verticillium)和钩丝孢属(Harposporium)及担子菌门毒虫霉属(Nematoctonus)等线虫内寄生真菌中一些种则通过产生黏性孢子附着于线虫上，生出芽管进入虫体并产生大量菌丝体进行侵染[26]。钩丝孢属的一些种则能够产生可以被线虫吞食的孢子，进入线虫体内后附着于线虫肠壁表面并萌发形成大量菌丝体，消耗尽线虫内含物后穿透体壁。明尼苏达被毛孢(Hirsutellaminnesotensis)和圆锥掘氏梅里霉(Drechmeriaconiospora)可以产生大量的黏性孢子侵染线虫，成熟的分生孢子在端部形成黏性芽黏附到线虫的感知结构上[27]。在线虫的表皮内形成囊泡，然后在线虫内产生菌丝体。菌丝生长消化分解线虫，通常在3 d内形成新的分生孢子并从线虫体内伸长出来。黏口孢属(Haptoglssa)是孢子萌发后形成细胞枪，将孢子注射到线虫体内以达到侵染线虫的目的[28]。

2.3 产毒真菌

产毒菌物分泌产生的代谢产物往往通过不同的作用靶标定向改变线虫的正常生理行为，以达到抑制或杀死线虫的目的[29]，其主要通过神经毒作用、破坏体壁、抑制功能酶和促进植物生长发育4种途径实现杀线虫的功能。首先，产毒菌物可以通过神经毒作用扰乱线虫的神经系统，使线虫代谢功能紊乱达到杀虫的效果，阿维菌素可以促进神经细胞末端释放γ-氨基丁酸，增强γ-氨基丁酸与线虫的运动神经元受体结合，影响神经信号的传递[30]。其次，产毒菌物可以通过破坏线虫的体壁，改变线虫体内的渗透压达到杀虫的效果，研究表明，寡孢节丛孢(Arthrobotrysoligospora)可以分泌几丁质酶和丝氨酸蛋白酶降解线虫的体壁[31-32]，淡紫拟青霉(P.lilacinus)可以分泌角质层降解酶从而提高杀线虫活性[33-34]。再次，产毒菌物可以通过抑制线虫体内某些重要功能酶的活性达到杀虫的效果，寡孢节丛孢可以分泌单体GTP酶，抑制线虫体内物质的聚集和跨膜转运[35]，弯茎霉属(Tolypocladium)真菌可以分泌ATP酶抑制剂抑制线虫体内ATP酶的活性，绿色木霉(Trichodermaviride)通过分泌胶霉毒素和绿色菌素防治番茄南方根结线虫[36]。同时，产毒菌物可以通过分泌一些植物激素促进植物生长发育，提高植物对线虫的免疫，从而间接达到抗虫的目的，食线虫真菌可以提高植物对磷的吸收并促进植物生长从而抵抗线虫的侵袭[37]。

2.4 机会真菌

机会真菌一般不直接寄生于线虫上，只有在一定的环境条件下，才会定殖于线虫的胞囊或卵囊等繁殖体上并利用线虫体内的营养物质生长，同时产生多种酶抑制线虫卵的孵化。目前针对镰刀菌(Fusariumoxysporum)和淡紫拟青霉(P.lilacinus)等机会真菌的研究较深入，其作用机制主要是通过产生活性代谢物质抑制线虫卵发育或直接杀死卵，以对成虫群体数量产生抑制作用[38]。而在线虫体内机会真菌的作用机制基本上与线虫内寄生真菌类似。

3 防控效果影响因素

从近几年来的实践效果来看，生物菌剂在室内条件下防治线虫均可达到理想效果，但实际应用过程中却不理想，这主要是由于众多的非生物因素和生物因素影响了防治线虫效果，主要包括在预施阶段食线虫真菌毒力的损失质控不足、施放面积和规模的扩大涉及到的人为不可控和未知因素会随时间和空间变化等。

3.1 非生物因素

本文所述的非生物因素是指通过利用食线虫真菌防治线虫的环境因子和土壤。在所有环境因子中，紫外线照射使暴露在外的孢子失活是最多被报道的环境因素，在一项研究中发现，5 min的紫外线照射就可以抑制捕食线虫真菌寡孢节丛孢(A.oligospora)和白色隔指孢(Dactylellacandida)捕食线虫[39]。对滇西北高黎贡山和苍山食线虫真菌垂直分布的研究表明，温度、降雨量同样可以导致食线虫真菌垂直分布模式呈现差异性，并随着海拔升高食线虫真菌的物种丰富度和检出率呈先升后降趋势[40]。土壤作为生物体缓冲的必备生物介质，其理化特性如湿度、温度、盐碱度、质地、类型、重金属含量和凋落物均会影响食线虫真菌的杀线虫能力，因为这些因素可影响食线虫真菌生长发育或者提高病原线虫对食线虫真菌的拮抗活性[41]。这些因素的不同组合，同样也可以影响微生物防治效果。研究表明，土壤的温度、pH值、碳氮比均会影响线虫卵寄生真菌厚垣孢普克尼亚菌(Pochoniachlamydosporia)对南方根结线虫的寄生活性[42-43]。尽管食线虫真菌在实验室中会抑制和杀死线虫，但是在自然土壤中效果并不明显。原因是自然环境土壤中微生物种群十分庞杂，例如在温带草原土壤中真菌的总生物量密度可以达到2～5 t/hm2[44]。土壤中存在许多腐生真菌，对线虫具有侵染作用，但并不会杀死线虫，由于这些腐生真菌占据了食线虫真菌的生态位，抑制了食线虫真菌对线虫的入侵，间接保护线虫不被食线虫真菌侵染。

3.2 生物因子

食线虫真菌的致病性与寄主线虫种类、发育阶段相关，早期发育阶段的卵和幼虫更容易受到真菌感染[45]。生物防治剂的开发和推广应用，需要不断研究和发现不同食线虫真菌在各类寄主线虫不同发育阶段的感染能力差异。

植物对食线虫真菌的影响有3个方面：第一，植物寄主对线虫侵扰敏感性直接影响食线虫真菌防治线虫；第二，植物的化感作用会分泌一些植物激素防治线虫，同时抑制食线虫真菌发挥作用；第三，寄主植物有自己独有的生物群落，外来引进的食线虫真菌与本地植物自身生物群落会发生相互作用，从而产生相互抑制作用[46]。

人工干预对食线虫真菌防治病原线虫的影响最大。传统农业漫灌影响食线虫真菌孢子在土壤中的数量及分布，同时各种农林业农药的过度使用也严重影响食线虫真菌对病原线虫的防治效果，作物的轮作和土地改良同样影响食线虫真菌的作用效果[47]。不仅如此，作物收获后遗留的秸秆等分解后同样也会改变土壤的理化性质，从而影响食线虫真菌的种群稳定，导致防治效果下降[48]。

综上所述，食线虫真菌对植物病原线虫的防治效果受一系列复杂的内在和外在综合因素调控。了解这些影响因素可以改善食线虫真菌防治线虫的水平，充分发挥二者的协同作用，有效提高食线虫真菌对线虫的防治效果。因此，防治效果取决于寄主植物-宿主线虫-食线虫真菌-环境的相互作用，只有调控好这些因素的协同关系，才能达到改善植物生长环境，降低线虫的虫口密度，保护农林作物免受线虫侵袭，获得高经济效益的目的。因此，食线虫真菌除了对病原线虫应具有稳定的毒力外，在应用这些微生物防治之前还必须令所选菌株满足一系列特性：对环境友好、能够适应所在环境、可以传代培养并且毒力不受传代次数影响、对植物生长有利。因此，若想提高生物菌剂的防治效果，必须提高土壤中有机质含量，调节土壤pH值，提高食线虫真菌活性，在生物防治线虫方面寻求更大进展。

4 食线虫真菌应用现状

近年来，随着高通量测序技术的迅速发展，目前已经有8种食线虫真菌的基因组完成测序，包括4种捕食线虫真菌寡孢节丛孢(A.oligospora)[49]、坚黏孢单顶孢(Dactylellinahaptotyla)[50]、产生收缩环的真菌直索小掘氏孢(D.stenobrocha)[51]和弯孢节丛孢(Arthrobotrysmusiformis)[52]，2种线虫卵寄生真菌淡紫拟青霉(P.lilacinum)[53]和厚垣孢普克尼亚菌(P.chlamydosporia)[54]以及 2 种内寄生真菌明尼苏达被毛孢(H.minnesotensis)[55]和圆锥隔指孢(D.coniospora)[56]，这极大地促进了关于食线虫真菌对线虫的侵染作用方式和过程的研究。食线虫真菌的基因组测序结果为研究食线虫真菌侵染线虫的关键基因提供了依据，为更好地阐明真菌侵染机制提供了有力证据，为无公害杀线剂的开发和利用提供了理论基础。

4.1 真菌对线虫的直接应用

早在1914年，就有人提出应用食线虫真菌防治植物寄生线虫的建议[57]。CORDA在1839年发现并创立了节丛孢属(Arthrobotrys)，随后德国科学家ZORF发现节丛孢属真菌能够形成捕虫网捕食线虫，开启了食线虫真菌的研究[58]。而之后的100多年，对线虫的防治主要是将菌种直接施放到病原线虫所处的环境中，例如1978年法国科学家CAYROL分别用粗状节丛孢(A.robusta)和不规则节丛孢(A.irregalaris)防治双孢蘑菇菌丝寄生线虫和蔬菜根结线虫[59]。20世纪90年代，研究人员还通过对食线虫真菌进行包埋和冻干来延长菌种的持效期，以达到长期杀虫的效果[60-61]。

不同类型的食线虫真菌作用于线虫的机制不同，但它们共同的特点是都需要突破线虫的体壁才能作用并杀死线虫，因此食线虫真菌产生的丝氨酸蛋白酶、几丁质酶、小分子分泌蛋白和次级代谢产物等毒力因子在防治线虫中发挥重要作用[62]。厚孢轮枝菌(V.chlamydosporium)通过孢子萌发产生菌丝，与线虫卵接触后刺破卵壳，进而降解卵壳、卵黄质、几丁质层和原生质体，最终杀死线虫的雌虫及卵，而淡紫拟青霉(P.lilacinus)孢子则在土壤中萌发产生菌丝，菌丝碰到线虫卵后分泌几丁质酶分解线虫和虫卵中的壳寡糖，溶解线虫体壁和卵壳，随后菌丝以卵内物质为食物大量繁殖，破坏线虫卵从而抑制线虫幼虫孵化[63]。

4.2 真菌对线虫的间接应用

尽管以微生物杀线剂为主的环境友好型生物防治逐年成为热点，但是由于其成本高、不可与杀菌剂混用以及对技术要求高等缺点，致使化学防治仍为目前植物病原线虫最主要的防治方法，占总防治方法的80%以上[64]。尽管常用的微生物杀线剂如阿维菌素等具有杀线速度快、使用剂量低、对环境污染小等优点，但却存在易被土壤颗粒吸附、降解迅速、防效短、对植物内线虫无效等缺点。因此，研究人员将化学杀线剂与生物杀线剂进行复配使用，以减少化学杀线剂导致的环境问题。研究表明，化学类杀线剂与微生物源杀线剂复配对多种植物线虫具有增效作用，例如通过将淡紫拟青霉(P.lilacinus)与放线菌复配防治根结线虫，防治效果优于单独使用单个菌株[65]。氟吡菌酰胺和阿维菌素拌种对小麦孢囊线虫有较好防治效果[66]。噻唑膦作为一种杀线效果很好的内吸型杀线剂，与植物生长激素氨基寡糖素复配可以有效抑制柑橘根际土壤及根际上的线虫基数[67]。阿维菌素和噻唑磷复配可以使药效互补，既减少化学杀线剂使用又提高杀线效果，还避免线虫出现抗药性[68]。WANG等[69]研究发现，细菌产生的尿素可以刺激食线虫真菌产生捕食器官捕食线虫。

面对食线虫真菌的侵扰，线虫同样也存有一系列的免疫调控机制。例如线虫的表皮及咽部中表达的HPX-2对维持线虫角质层结构完整，保护线虫免受致病菌侵袭有重要作用，当利用生物技术除去HPX-2的活性功能区域，线虫对致病菌Enterococcusfaecalis的敏感性明显上升[70]。经证实，食线虫真菌感染秀丽线虫后可激活胰岛素通路、细胞程序性死亡、β转化生长因子、丝裂原激活的蛋白激酶4种先天免疫信号通路，影响线虫的发育以达到杀虫的目的[71]。

5 讨论

植物寄生线虫作为一类植物病原，导致大量农林作物枯萎死亡，造成严重的经济损失。尽管目前人们对食线虫真菌侵染杀线虫机制有了较深入的研究，但对植物病原线虫免疫食线虫真菌的基因功能研究还比较匮乏[72]。因此，探究稳定高效的分子操作体系，开发精准高效的试验技术，对研究植物病原线虫免疫系统，探究食线虫真菌的毒力机制，解决植物寄生线虫分子生物学研究的技术瓶颈至关重要。随着多种测序技术的飞速发展，多组学联合研究为进一步鉴定和了解侵染过程中真菌与线虫互作的信号传导网络和表达调控网络等侵染机制提供了方向。

随着现代环保和生态文明理念的深入人心，食线虫真菌作为一种植物寄生线虫生物防治方法受到了广泛关注[73]。食线虫真菌在菌种资源调查、高效生防真菌菌株筛选、菌剂研制和田间技术应用等方面均取得了诸多成绩[74]。但从目前的防治实践来看仍存在一些亟待解决的问题，例如缺乏高效稳定的生防菌种，对食线虫真菌在不同环境中的定殖、食线虫真菌对线虫作用的分子作用机制和线虫对食线虫真菌的分子应答机制还缺乏了解。因此，作为农林业研究人员，应充分认识食线虫真菌对线虫的干预形式，掌握线虫对食线虫真菌的分子响应机制，整合化学、材料科学、表观遗传学、系统进化学、生物信息学及免疫学的多领域资源，开展植物寄生线虫防控治疗方案的研究，建立精准靶标生物农药治理植物寄生线虫，改善植物病原线虫的危害现状，最终以无污染的方式提高农林作物的产量。