β-石竹烯激活自噬减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制

周智华，杜琼颖，郅青

急性心肌梗死是临床常见的心血管疾病，介入或溶栓等再灌注治疗是其急诊的有效疗法，及时再通冠状动脉（冠脉）、恢复缺血心肌血供，可明显减轻心肌损伤。但治疗后心肌会发生缺血再灌注损伤，造成梗死面积扩大、恶性心律失常及心力衰竭发生风险的增加，对再灌注疗效产生不利影响，需积极防治[1,2]。心肌缺血再灌注损伤的机制复杂，其中细胞自噬在心肌再灌注过程中起到重要作用。多项研究发现，缺血再灌注心肌中细胞自噬明显激活，使用自噬激动剂雷帕霉素能够减轻心肌损伤、使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）能加重心肌损伤[3,4]。自噬成为近年来防治心肌缺血再灌注损伤的热门靶点之一。

β-石竹烯是一类双环倍半萜型天然物质，广泛存在于肉桂、丁香等植物中，具有抗凋亡、促自噬等生物学作用。脑缺血再灌注相关的动物实验发现，β-石竹烯能够减轻脑缺血再灌注损伤并激活缺血脑组织的自噬，增加自噬标志基因beclin-1及LC3-II/LC3-I的表达[5]，但其在心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制不楚。本研究将在心肌缺血再灌注损伤小鼠中观察β-石竹烯激活自噬减轻心肌损伤的作用及机制，旨在为发现心肌缺血再灌注损伤新的防治药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物雄性C57BL/6J小鼠购自赛业模式生物研究中心（太仓）有限公司，体质量18～24 g，许可证号：SCXK(苏)2018-0003。

1.2 试剂与仪器β-石竹烯、3-MA购自美国Sigma公司，乳酸脱氢酶（LDH）、磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB）检测试剂盒购自上海酶联公司，TTC染色液购自南京森贝伽公司，HE染色试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝公司，Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3（LC3）一抗购自CST公司。正置显微镜为苏州上光仪器有限公司，透射电镜为上海斯坦德检测公司，凝胶电泳系统及成像系统为上海天能公司。

1.3 动物分组、造模及给药实验动物随机分为假手术组、模型组、β-石竹烯组、3-MA组、β-石竹烯+3-MA组共五组，每组各16只。假手术组：进行麻醉、开胸、分离冠脉等手术操作，但不结扎；模型组：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后气管插管、连接小动物呼吸机，开胸并分离左前降支，结扎缝线、使心肌缺血30 min，而后剪断结扎的缝线、使心肌再灌注2 h，心电图监测ST段改变；β-石竹烯组：给予72 mg/kg β-石竹烯灌胃，1/d，连续5 d，末次灌胃后1 h按照模型组的方法行心肌缺血再灌注造模；3-MA组：造模前15 min给予15 mg/kg 3-MA腹腔注射，而后按照模型组方法进行心肌缺血再灌注造模；β-石竹烯+3-MA组：给予72 mg/kg β-石竹烯灌胃，1/d，连续5 d，末次灌胃后1 h按照模型组的方法进行心肌缺血再灌注造模，造模前15 min给予15 mg/kg 3-MA腹腔注射。

1.4 血清心肌酶含量的检测经心脏取血1.0～1.5 ml，静置0.5 h后自然凝血，3000转离心10 min，分离血清后检测LDH和CK-MB含量，严格按试剂盒说明书操作。

1.5 心肌TTC染色每组小鼠随机选择8只，取心脏在-80℃冰冻1 h，制成2 mm切片、5～6片，将切片放入1%TTC染色液中，37℃避光染色30 min。完成后磷酸盐缓冲液清洗3遍，数码相机拍照记录并在Image J软件中分析心肌梗死面积，梗死心肌呈灰白色、未梗死心肌呈砖红色，按照公式（心肌梗死面积之和/全心面积之和）×100%计算心肌梗死面积。

1.6 心肌HE染色每组小鼠剩余8只，取缺血再灌注的心肌组织适量，4%多聚甲醛固定后制作病理切片，HE染色试剂盒行染色操作，中性树胶封片后在显微镜下观察心肌病理改变。

1.7 自噬小体的检测取缺血再灌注的心肌组织适量，制成约1 mm3的组织块，在2.5%戊二醛溶液中固定并保存，检测时用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗组织块3次，放入1%锇酸中、4℃固定1 h，经70%、80%、95%、100%乙醇溶液梯度脱水后，环氧树脂包埋，-80℃聚合24 h，制作成60～70 nm厚度的切片并用3%柠檬酸铅染色，透射电镜下观察，随机选择5个视野对自噬小体进行计数。

1.8 自噬基因表达的检测取缺血再灌注的心肌组织适量，采用RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白含量，取含有30 μg蛋白的样本进行western blot检测，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，电转移至PVDF膜后用5%脱脂牛奶在室温封闭1 h，4℃孵育1:1000稀释的 Beclin-1、LC3一抗或1:2500稀释的β-actin一抗过夜，洗膜3次后室温孵育1:2000稀释的二抗1 h，最后在凝胶成像仪中曝光得到蛋白条带并计算灰度值，以Beclin-1/β-actin、LC3-II/LC3-I的比值作为表达水平。

1.9 统计学方法用SPSS 13.0统计学软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五组小鼠心电图的比较五组小鼠心电图的变化（图1）。与假手术组比较，模型组小鼠心电图ST段明显抬高（P＜0.05）；与模型组比较，β-石竹烯组小鼠心电图ST段明显降低，3-MA组小鼠心电图ST段明显抬高（P＜0.05）；与β-石竹烯组比较，β-石竹烯+3-MA组小鼠心电图ST段明显抬高（P＜0.05），表1。

表1 五组小鼠心电图ST段的比较（n=16）

图1 五组小鼠心电图的变化

2.2 五组小鼠血清心肌酶含量的比较与假手术组比较，模型组小鼠血清中LDH、CK-MB的含量明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，β-石竹烯组小鼠血清中LDH、CK-MB的含量明显降低，3-MA组小鼠血清中LDH、CK-MB的含量明显增加（P＜0.05）；与β-石竹烯组比较，β-石竹烯+3-MA组小鼠血清中LDH、CK-MB的含量明显增加（P＜0.05），表2。

表2 五组小鼠血清LDH、CK-MB含量的比较（n=16）

2.2 五组小鼠心肌梗死面积的比较与假手术组比较，模型组小鼠的心肌梗死面积明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，β-石竹烯组小鼠的心肌梗死面积明显降低，3-MA组小鼠的心肌梗死面积明显增加（P＜0.05）；与β-石竹烯组比较，β-石竹烯+3-MA组小鼠的心肌梗死面积明显增加（P＜0.05），图2。

图2 五组小鼠心肌梗死面积的比较（TTC染色）

2.3 五组小鼠心肌病理改变的比较假手术组心肌HE染色可见细胞排列整齐、呈束状分布；模型组心肌HE染色可见细胞肿胀且排列混乱、大量炎症细胞浸润等病理改变；β-石竹烯组心肌HE染色可见病理改变较模型组改善，3-MA组心肌HE染色可见病理改变较模型组加重；β-石竹烯+3-MA组心肌HE染色可见病理改变较β-石竹烯组加重（图3）。

图3 五组小鼠心肌病理改变的比较（HE染色）

2.4 五组小鼠心肌中自噬小体的比较与假手术组比较，模型组小鼠心肌中自噬小体数目明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，β-石竹烯组小鼠心肌中自噬小体数目明显增加， 3-MA组小鼠心肌中自噬小体数目明显减少（P＜0.05）；与β-石竹烯组比较，β-石竹烯+3-MA组小鼠心肌中自噬小体数目明显减少（P＜0.05），图4。

图4 五组小鼠心肌中自噬小体的比较

2.5 五组小鼠心肌中自噬标志基因表达的比较与假手术组比较，模型组小鼠心肌中Beclin-1、LC3-II/LC3-I的表达水平明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，β-石竹烯组小鼠心肌中Beclin-1、LC3-II/LC3-I的表达水平明显增加，3-MA组小鼠心肌中Beclin-1、LC3-II/LC3-I的表达水平明显减少（P＜0.05）；与β-石竹烯组比较，β-石竹烯+3-MA组小鼠心肌中Beclin-1、LC3-II/LC3-I的表达水平明显减少（P＜0.05），见图5及表3。

表3 五组小鼠心肌中Beclin-1、LC3-II/LC3-I表达的比较（n=16）

图5 五组小鼠心肌中Beclin-1、LC3-II、LC3-I的蛋白条带

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是影响急性心肌梗死再灌注治疗效果的重要因素，防治心肌缺血再灌注损伤是近年来心血管研究的热点。β-石竹烯是广泛存在于多种植物中的双环倍半萜化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等生物学作用。多项脑缺血再灌注相关研究发现，β-石竹烯能够减轻缺血再灌注引起的神经损害[5-7]；另有研究发现，β-石竹烯在脑出血、衰老、抑郁等动物模型中也起到神经保护作用[8-10]。本研究将β-石竹烯用于心肌缺血再灌注损伤的治疗。在小鼠心肌缺血再灌注损伤造模前给予β-石竹烯灌胃干预并观察到：心电图ST段及血清中心肌酶LDH及CK-MB含量降低、梗死面积缩小、病理改变减轻，表明β-石竹烯能够减轻小鼠心肌再灌注损伤。

心肌缺血再灌注损伤的病理生理机制复杂，涉及凋亡、炎症、氧化应激、自噬等环节[11-13]。自噬是细胞通过溶酶体吞噬衰老、受损蛋白质及细胞器的过程，有助于维持细胞内环境稳定。自噬小体形成是自噬激活的特征，而Beclin-1和LC3两种基因在自噬小体形成过程中起关键作用、其表达也能反映自噬的激活程度[14-16]。既往心肌缺血再灌注损伤[17]、心肌细胞缺氧复氧损伤[18]相关研究及本研究均发现：自噬在心肌缺血再灌注损伤过程中被激活，缺血心肌中自噬小体增多、Beclin-1及LC3-II/LC3-I的表达增加。本研究进一步在心肌缺血再灌注造模前给予自噬抑制剂3-MA干预，旨在阐明自噬激活在心肌缺血再灌注损伤中的作用，结果显示：3-MA预处理能够加重心肌缺血再灌注损伤的程度，表明自噬激活具有心肌保护作用，心肌缺血再灌注过程中自噬的激活可能是一种自我保护的代偿机制。

自噬是细胞内普遍存在的生物学现象，在脑缺血再灌注过程中细胞自噬过度激活且起到神经保护作用[19,20]；β-石竹烯相关的研究发现β-石竹烯对脑缺血再灌注过程中的细胞自噬具有激活作用[5]，提示β-石竹烯可能通过激活自噬发挥神经保护作用。本研究则在心肌缺血再灌注损伤过程中观察了β-石竹烯对自噬的调控作用，结果发现：β-石竹烯干预能够使缺血心肌中自噬小体增多、自噬标志基因Beclin-1及LC3-II/LC3-I的表达增加，表明β-石竹烯能够在心肌缺血再灌注过程中激活自噬，这也可能是β-石竹烯发挥心肌保护作用的分子机制。为验证这一机制，本研究进行了β-石竹烯及3-MA联合干预，发现自噬抑制剂3-MA削弱了β-石竹烯的心肌保护作用，β-石竹烯联合3-MA干预后小鼠心电图ST段、血清中LDH及CK-MB的含量高于单用β-石竹烯，心肌梗死面积及心肌病理改变也较单用β-石竹烯加重，结果表明β-石竹烯减轻心肌缺血再灌注损伤的作用与激活自噬有关。

综上所述，β-石竹烯能够减轻小鼠心肌再灌注损伤，激活自噬是可能的分子机制。为使用β-石竹烯进行心肌缺血再灌注损伤的防治提供了实验依据，也为阐明自噬在心肌缺血再灌注损伤中的作用、发现心肌缺血再灌注损伤新的防治靶点提供了思路。