三斜磷钙石糊剂封闭牙本质小管的体外研究

汤皓 朱亚文 朱家祥 李全利

安徽医科大学口腔医学院附属口腔医院，安徽医科大学安徽省口腔疾病研究重点实验室，合肥230032

牙本质敏感症（dentinal hypersensitivity，DH）是暴露的牙本质对外界刺激产生的短而尖锐的疼痛，这种疼痛不能归因为其他任何形式的牙齿缺陷或疾病，典型的刺激包括温度刺激、吹气刺激、机械性刺激、渗透压刺激和化学刺激[1]。从流行病学角度看，DH 是一种常见的非传染性公共卫生疾病，影响超过43% 的成年人[2]。目前，关于DH 的发病机制的假说中，流体力学理论最为广泛接受[3]。根据这一理论，治疗DH 主要有两种途径，一种是使用硝酸钾或氯化钾等物质提高钾离子水平以抑制神经纤维的兴奋，从而抑制疼痛的产生[4]，另一种是有效阻塞牙本质小管以阻止液体流动，如再矿化方法[5]、乙酸锶[6]、激光治疗[7]等，从而减轻临床症状。但是，目前常用的封闭牙本质小管技术与材料对牙本质小管封闭较浅，浸润深度有限，容易再次暴露，导致牙本质小管的开放[8-9]。通过释放钙磷元素再矿化的方法能够在牙本质表面和小管内再生矿物质，从而导致牙本质小管闭塞，目前该方法已在DH 治疗领域越来越受到重视。

目前商品化的能够释放钙离子和磷酸盐离子的抗敏牙膏，其活性成分主要有生物活性玻璃（bioactive glass，BG） 和纳米羟磷灰石（nano-hydroxyapatite，nHA） 两种[10]。含nHA 的牙膏虽然能够部分堵塞牙本质小管，但其较低的溶解度却限制了钙和磷酸盐离子的释放，影响治疗效果[11]。同样，BG 牙膏钙离子释放量也较少[12]。含BG 的牙膏虽然能够在牙本质小管表面形成矿化的磷灰石层，从而封闭牙本质小管，但这一过程耗时较长，需要15 d 以上的时间才能在临床试验中取得理想的结果[13]。

三斜磷钙石（monetite，CaHPO4） 又称无水磷酸氢钙（dicalcium phosphate anhydrous， DCPA），是羟磷灰石（hydroxyapatite） 的前体物质，具有良好的生物相容性[14]。三斜磷钙石常作为一种能够释放钙的食用矿物质，广泛应用于食品加工业和牙膏等消费品中[15]。由于其溶解度大，可以在较短的时间内形成羟磷灰石，因而在骨组织工程中得到了广泛的应用[16]。最近的一项研究[17]表明，在骨水泥中添加三斜磷钙石后，该材料具有显著的再矿化潜力和优异的耐酸能力。三斜磷钙石还能有效吸收饮用水中的氟化物[18]，这对于牙齿的防龋具有重要意义。目前尚未见三斜磷钙石对牙本质小管封闭效果及其诱导牙本质矿化效果的研究报道。本研究采用球磨的机械化学合成方法，通过调控pH 值，获得含锶、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG） 的微纳结构的三斜磷钙石、羟磷灰石糊剂的钙磷制剂；体外模拟日常刷牙，评价其堵塞牙本质小管的效果。

1 材料和方法

1.1 三斜磷钙石糊剂和羟磷灰石糊剂的制备与分析

将0.13 g 六水合氯化锶溶于4.23 mL 的85%H3PO4溶液中，加入2.51 g PEG （平均相对分子质量4 000，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），搅拌至完全溶解。再缓慢加入5.60 g 的CaO。然后，将糊剂转移到球磨机（YXQM-0.4L，长沙米淇仪器设备有限公司），在250 r·min-1下研磨8 h后，加入8 mL 3% 的双氧水，用磷酸调整pH 值至4.3，放置在球磨机里，继续研磨16 h 制备三斜磷钙石糊剂。同法制备羟磷灰石糊剂，但不用磷酸调整pH 值，而用6 mol·L-1的NaOH 溶液调整到pH值为7.5。2 种不同的糊剂置于4 ℃下密封保存。

分别取适量的糊剂冷冻干燥处理，并研磨成粉末。场发射扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）（GeminiSEM 500，ZEISS公司，德国） 检测糊剂的形态，X 射线衍射（X-ray diffraction，XRD）（X’Pert PRO MPD，Panalytical 公司，荷兰）和傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer， FTIR）（Nicolet iS50，Thermo Fisher 公司，美国） 分析糊剂的晶体结构和成分。

1.2 DH体外研究模型的制备

在安徽医科大学附属口腔医院收集拔除的健康成人第三磨牙。用低速金刚石切割机（SYJ-150，北京世纪科信科学仪器有限公司） 在釉质牙本质界上方4 mm 处，沿垂直于牙体长轴的方向切取牙本质片，共计60个。牙本质片厚度为1.00 mm±0.08 mm。碳化硅抛光纸（600～2 000 目） 进行梯度抛光，每种砂纸抛光时间为60 s。样本依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声处理15 min。

将牙本质片用35%磷酸酸蚀20 s，去除表面污染层（smear layer）、脱矿、暴露牙本质胶原纤维，用5%NaClO 溶液处理10 min，去除暴露的胶原蛋白。获得DH 模型。所有样本储存在1% 氯胺-T 溶液4 ℃保存。

1.3 牙本质片的分组

根据使用的再矿化剂，将牙本质片分为4 组，每组15个样本（n=15），均随机分配。具体组别如下。空白对照组：蒸馏水处理。酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙（casein peptide phosphate-amorphic calcium phosphate，CPP-ACP）组：CPP-ACP糊剂（护牙素，GC 株式会社，日本） 处理，作为阳性对照。三斜磷钙石糊剂组：三斜磷钙石糊剂处理。羟磷灰石糊剂组：羟磷灰石糊剂处理。

1.4 牙本质片的再矿化

各组样本表面分别用相对应的再矿化剂涂刷3 min，静置15 min，去离子水冲洗1 min 后，分别置入50 mL 的人工唾液[1.5 mmol·L-1CaCl2，0.9 mmol·L-1KH2PO4，20 mmol·L-14-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸，130 mmol·L-1KCl，1%氯胺T；pH=7.0][19]，37 ℃恒温保存12 h。继续按照上述方法处理样本，连续7 d。

再矿化7 d 后，从三斜磷钙石糊剂组和羟磷灰石糊剂组中分别随机挑选5个样本，用不含处理剂的牙刷刷洗3 min，每天2 次，其余时间置入人工唾液，37 ℃恒温保存，连续处理7 d，评价2 组再矿化物的耐久性能。其余样本储存在1% 氯胺-T 溶液中4 ℃保存。所有样本处理完毕后，依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声处理15 min，自然干燥，保存，供检测评价使用。

1.5 检测分析

形貌观察：每组随机选取3 个样品，SEM 观察样品表面与断面的形貌。

显微硬度测定：每组随机选取5个样品，矿化处理前使用显微硬度计（MHV-2000Z，上海蔡康光学仪器有限公司）（Vickers 压头，50 g，20 s）测定获得样本表面显微硬度（surface microhardness，SMH） 基线，记为SMH1。每个样品的硬度值为z 形走向选区（200 μm × 200 μm） 9 个点的平均值。同样测定矿化后样品表面显微硬度，记为SMH2。计算SMH2 与表面显微硬度基线SMH1 的差值ΔSMH。

矿化后样品表面沉积物结构分析：选取矿化后样品，进行表面XRD分析。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件进行数据输入和分析，再矿化前后SMH 值的比较采用配对t检验（Student’s pairedt-test），各组SMH1、ΔSMH 的比较采用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），两两比较采用Bonferroni 校正法（Bonferroni correction），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三斜磷钙石糊剂和羟磷灰石糊剂的分析

SEM 结果显示：三斜磷钙石糊剂中三斜磷钙石的形态不规则，大小不均匀，从数十到数百纳米不等（图1 A）。羟磷灰石糊剂中，羟磷灰石晶体大小更为均匀，直径较小，多为数十纳米，呈颗粒状（图1 B）。

图1 2种糊剂的SEM × 50 000Fig 1 SEM of two pastes × 50 000

XRD 分析（图2） 表明：三斜磷钙石糊剂的XRD 图谱中，2θ为26.5°时衍射峰为（200），2θ为30.2°时衍射峰为（-120），2θ 为32.8°时衍射峰为（-202），与国际衍射数据中心（International Centre for Diffraction Data，ICDD） 的三斜磷钙石粉末衍射卡（powder diffraction file，PDF）（PDF No.70-0360） 匹配良好；羟磷灰石糊剂XRD 图谱中，在2θ=25.8°处衍射峰为（002），2θ=31.7°处衍射峰为（211），2θ=32.9°处衍射峰为（300），2θ=34.0°处衍射峰为（202）， 与羟磷灰石粉末衍射卡（PDF No. 74-0566） 匹配良好。

图2 2种糊剂的X衍射光谱Fig 2 XRD spectra of two pastes

FTIR 分析（图3） 表明：无论是三斜磷钙石糊剂的FTIR图谱，还是羟磷灰石糊剂的FTIR图谱中，都存在P-O 的伸缩振动吸收峰1 131 cm-1和1 066 cm-1、 P-O 的弯曲振动吸收峰580 cm-1和528 cm-1，这与三斜磷钙石及羟磷灰石中的P-O 特征相吻合。2种糊剂的FTIR图谱也都存在-OH的伸缩振动吸收峰3 431 cm-1、-OH 的弯曲振动吸收峰1 636 cm-1，这与三斜磷钙石及羟磷灰石中的羟基特征相吻合；而-CH2-的伸缩振动吸收峰2 886 cm-1则对应PEG中的端羟基。

图3 2种糊剂的FTIR图谱Fig 3 FTIR spectra of two pastes

2.2 牙本质再矿化

SEM 观察显示脱矿后牙本质表面粗糙，牙本质小管口开放，直径4～6 μm （图4 A）。

经过7 d 矿化处理后，空白对照组牙本质表面未见明显变化（图4B）；CPP-ACP 组牙本质小管内出现矿化，表面也有部分沉积，但矿化速度较慢，牙本质小管封闭较少（图4C）；三斜磷钙石糊剂组牙本质表面被矿化层完全覆盖，部分牙本质小管中堵塞物表层较为疏松，为片状矿化产物（图4E），样本断面可见矿化层厚3～6 μm，较为致密，矿化物进入牙本质小管内，小管被完全堵塞，部分堵塞的牙本质小管内矿化物为片状（图4F）；羟磷灰石糊剂组牙本质表面被矿化物完全覆盖，表面可见部分突起（图4G），其断面可见矿化层厚1.5～4 μm，与牙本质表面界限不清，但矿化物并未完全进入牙本质小管内，管内可见针状矿化物（图4H）。

图4 脱矿后矿化前及矿化7 d后牙本质片的SEM图像Fig 4 SEM images of dentin slices after demineralization before mineralization and after 7 days of mineralization treated with test reagent

经过7 d 模拟刷牙的机械刷洗后，三斜磷钙石糊剂组和羟磷灰石糊剂组表面沉积物与牙本质小管内部矿化物都未见明显变化（图5）。

图5 经过7 d 模拟日常刷牙的机械刷洗后的再矿化牙本质片SEM图Fig 5 SEM images of remineralized dentin slices after 7 days of mechanical brushing simulating daily brushing

经过7 d矿化处理后，XRD分析显示，三斜磷钙石糊剂组牙本质表面生成的矿化层在2θ=25.9°处衍射峰为（002），2θ=31.8°处衍射峰为（211），2θ=32.9° 处衍射峰为（300）， 2θ =39.8° 处衍射峰为（310）， 与氟化碳酸羟磷灰石[fluorocarbon hydroxyapatite，Ca10（PO4）5CO3（OH） F]粉末衍射卡（PDF No. 21-0145） 匹配良好（图6 A）；羟磷灰石糊剂组牙本质表面生成的矿化层在2θ=10.8°处衍射峰为（100），2θ=25.9°处衍射峰为（002），2θ=31.8°处衍射峰为（211），与羟磷灰石粉末衍射卡（PDF No. 74-0566） 匹配良好（图6 B）。

图6 7 d矿化处理后样本表面XRD光谱Fig 6 XRD spectra of the surface of the samples after 7 days of mineralization treated with two kinds of mineralized paste

各组矿化前后牙本质表面的显微硬度见表1。再矿化前各组牙本质片SMH 差异不具有统计学意义（P＞0.05）。除空白对照组矿化前后SMH差异不存在统计学意义（P＞0.05） 外，CPP-ACP 组、三斜磷钙石糊剂组和羟磷灰石糊剂组矿化前后SMH差异均存在统计学意义（P＜0.05）。羟磷灰石糊剂组的ΔSMH 大于三斜磷钙石糊剂组和CPP-ACP组，差异存在统计学意义（P＜0.05），三斜磷钙石糊剂组和CPP-ACP 组的ΔSMH 不存在统计学意义（P＞0.05）。三者的ΔSMH 均大于空白对照组（P＜0.05）。

表1 各组矿化前后牙本质SMHTab 1 SMH of dentin slices before and after mineralization in each group MPa

3 讨论

磷酸钙盐转化形成羟磷灰石的原理是基于磷酸盐在水中溶解度的差异性。对CaO-H3PO4体系合成羟磷灰石的热力学分析发现，反应过程中存在着DCPA、磷酸三钙（tertiary calcium phosphate，TCP）、羟磷灰石3 种沉淀物，其合成过程经历了DCPA-TCP-羟磷灰石的转化过程，当pH 值大于6时，羟磷灰石溶解度最小，该条件下有利于羟磷灰石的生成。然而在使用球磨法制备磷酸钙的实际操作中，通过调节pH 值，并未发现有明显的磷酸三钙的过渡阶段。当pH 值高时，由于它的溶解度最小，在热力学上的稳定性更高，倾向于形成更加稳定的羟磷灰石；而当pH 值低时，则更倾向于形成DCPA。

酸碱中和合成羟磷灰石是液固多相、多步反应，CaO 溶于水后生成的氢氧化钙微溶于水，产物羟磷灰石微溶于水，部分中间产物也微溶于水，因此反应过程受到Ca（OH）2的溶解、电离及生成物在Ca（OH）2颗粒表面沉积的影响，这种情况在一定程度上将限制溶液同界面处离子的扩散传递，最终导致多步合成反应进行不彻底，生成的DCPA和羟磷灰石中均存在杂相。因此需要采取必要的措施预防和破坏包覆层。在合成工艺中增加球磨处理，球磨过程中机械力能够破碎在颗粒表面的沉积层，增加液固界面传递，使反应进行的彻底，提高产物的纯度。同时，在球磨过程中机械能能够破坏钙磷产物间的静电力和范德华力从而减少粉末的团聚。为了使得到的产物具有更高的分散性，粒度更小，增加表面能，提高溶解度，还向糊剂中加入了PEG，这是一种非离子型表面活性剂，其分子式为HO（CH2CH2O）nH，在该体系中应用PEG作为分散剂并不会对最终产物造成影响。

封堵材料的化学成分是影响抗敏性的一个因素。在材料中加入锶离子可以有效缓解DH 引起的疼痛[20]。锶的原子半径比钙的原子半径稍大，在矿物中很容易替代钙[21]，将锶掺入羟磷灰石中，Sr2+取代了羟磷灰石晶格中的Ca2+，导致晶格发生畸变，羟磷灰石的结晶性和降解性发生了改变[22]。在锶含量较低时，随着锶含量的增加，磷灰石的溶解度增加[23],从而使口腔中的钙磷元素增加，有利于再矿化物的形成进而堵塞牙本质小管。此外，傅远飞等[24]的实验证明了掺锶磷灰石对细胞没有毒性。

磷酸钙进入并封堵牙本质小管主要有两种方式：如果颗粒尺寸大于牙本质小管直径，则主要靠释放钙离子和磷酸盐离子到小管中，引起沉淀；如果充填物的尺寸小于小管的直径，材料可以进入小管，在原位诱发矿化。这两种方法均可以在牙齿表面产生羟磷灰石来缓解DH 引发的疼痛[25]。本实验中，虽然牙本质表面的矿化层厚度相近，但在小管内，三斜磷钙石的矿化效果更好。这是由于生成的DCPA的溶解度大于羟磷灰石，因此能够提供更多钙离子和磷酸盐离子进入到牙本质小管中，而羟磷灰石的颗粒虽然小于DCPA，可以进入牙本质小管，但由于结块，往往只能停留在管口。因此，适当大小的颗粒和较高的溶解度将有助于堵塞牙本质小管。

被羟磷灰石堵塞后的牙本质小管深部的矿化产物多为针状。这是由于羟磷灰石晶体的生长主要存在着a、b 轴和c 轴方向，其中在c 轴方向生长基元是最稳定的，即羟磷灰石是优先沿着c轴方向长大，形成的产物为针状[26]，在反应初期，羟磷灰石晶体优先向着c轴方向生长，随着反应时间的延长，反应产物的传质量增加，羟磷灰石晶体也沿着a、b 轴方向生长，c 轴方向的生长优势减弱，随着反应时间延长，最后往往形成粒状。堵塞后的牙本质小管内钙磷浓度低，所以无法形成粒状羟磷灰石。而三斜磷钙石处理后的牙本质小管内及矿化层表面的片状矿化物形成的原因仍有待研究，可能是由于氟元素及二氧化碳的诱导作用所致[27]。

经过三斜磷钙石处理的牙本质表面生成物为氟化碳酸羟磷灰石。其生成的可能原因是在反应过程中有来自空气中的二氧化碳的参与，氟元素则可能来自牙本质本身。氟取代羟基后使得晶体的结构更加稳定，掺入的碳酸根与F-存在较强的离子交换作用，更加有利于碳酸根掺杂的磷灰石对氟的吸附[28]，在酸性条件下可以缓慢释放氟，促进牙齿的再矿化，有利于延长对DH治疗的临床疗效。

显微硬度检测显示三斜磷钙石糊剂处理后的牙本质表面的机械强度较HA 糊剂处理后的牙本质表面机械强度低，这与三斜磷钙石糊剂处理后牙本质表面不均匀分布的片状结构特征相吻合，羟磷灰石糊剂处理后的牙本质表面矿化层致密且均匀，因而机械强度较高。

经过7 d 机械刷洗，评价矿化物在口腔内的稳定情况。两种糊剂处理的表面沉积物与牙本质小管内的矿化物没有明显的变化。提示矿化沉积物可以在口腔内保持一定的稳定性。这可能与沉积物为磷灰石或含氟磷灰石有关。同时也说明沉积物在牙本质表面的再沉积与生长，而不是糊剂矿物粒子在牙齿表面的物理黏附。

日本GC 株式会社生产的护牙素被选作本实验的阳性对照，其中含有CPP-ACP。无定形磷酸钙（amorphic calcium phosphate，ACP） 与唾液接触时会释放钙和磷酸盐离子，转变为磷灰石，并使牙齿结构再矿化。CPP 是一种生物活性肽，含有多个磷酸化丝氨酸的氨基酸片段。其中一个活性序列，即磷酸丝氨酸（serine P，SerP） 和谷氨酸（glutamic acid，Glu） 簇，基本结构为-SerP-SerPSerP-Glu-Glu-Glu-。该序列可以使CPP产生对磷酸钙结合力，并在口腔中持续释放钙和磷酸盐离子[29]。无定形非晶体的磷酸钙能够不断的吸附在暴露的牙本质小管口表面，游离的钙、磷离子可缓慢地渗进牙本质小管内部，最终形成钙磷复合物结晶体，填塞于牙本质小管中，从而减缓小管内液体的流动的速度，减轻敏感症状。但这一过程需要较长的时间，在本实验中，经过CPP-ACP处理的牙本质小管并未发生明显的堵塞。

综上所述，三斜磷钙石糊剂具有显著的再矿化能力，可以较好地覆盖并渗透到暴露的牙本质小管中，阻塞牙本质小管，矿化物提高了脱矿牙本质的表面硬度。显示了对于DH治疗的潜在前景。利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。