干眼中结膜杯状细胞及其分泌的黏蛋白的变化

王振宇

随着社会的发展和视频终端的使用，干眼越来越成为影响人们身心健康的眼科常见疾病之一。世界范围内，约有四分之一的眼科患者会主诉与干眼相关的各种眼部不适。根据2017年TFOS DEWS II的定义，干眼是一种多因素疾病，以持续的泪膜不稳定为特征，引起眼部不适与视觉损伤，同时伴有不同程度的角膜上皮疾病及炎症[1]。正常眼表泪膜可分为三层，即表面的脂质层，中间的水液层和底面的黏蛋白层。结膜杯状细胞及其分泌的黏蛋白，在维持泪膜稳定及角膜上皮完整性上具有重要作用，成为干眼研究的一个重要领域。研究表明，年龄、眼表炎症、泪液高渗透压、局部药物毒性等多种情况都可导致结膜杯状细胞的丢失或功能异常，以及黏蛋白分泌的减少，造成泪膜稳定性下降和角膜上皮损伤，从而加重干眼的恶性循环。

一、结膜杯状细胞的生理特性

正常结膜是一个富含杯状细胞的粘膜组织，人类的杯状细胞通常散在分布，但在鼻侧有聚集[2]。泪液中的生长因子EFG及Th2细胞产生IL-13等因子具有促进杯状细胞的增殖以及蛋白合成的作用，而胆碱能神经递质可以刺激杯状细胞反射性地分泌黏蛋白[3，4]。结膜杯状细胞表达黏蛋白基因MUC5AC、MUC5B和MUC2，其中人类泪液中主要为黏蛋白MUC5AC[5]。黏蛋白具有维持眼表水润、泪液稳定等作用，还能够协助清除外界病原体和组织碎片[6，7]。角膜上皮会产生与细胞膜锚定的黏蛋白MUC1、MUC4和MUC16，目前还不清楚分泌的黏蛋白是否与角膜上皮锚定的黏蛋白产生相互粘附。

除了分泌黏蛋白，杯状细胞还是结膜免疫系统的重要组成部分。杯状细胞能够跨越2～3层上皮细胞的厚度，使它可以作为抗原传递者，将眼表的抗原传递给结膜基质中的单核巨噬细胞[8]。杯状细胞还能产生免疫调节因子，如TGF-β和维甲酸等，发挥免疫调节作用[9]。同时杯状细胞还是眼表固有免疫的主要成分，能够产生可溶性黏蛋白、三叶肽因子、防卫素和其他抗菌成分，阻止外界微生物的入侵[10，11]。呼吸道中的杯状细胞能够分泌细胞因子和白细胞介素，诱导Th2细胞反应，结膜杯状细胞是否有相同的功能还不清楚，但如果结膜杯状细胞缺失或者黏蛋白分泌减少会加重眼表炎症反应[12]。

杯状细胞与邻近结膜上皮细胞间的紧密连接由成孔连接蛋白2和成孔连接蛋白10组成，从而形成能够“渗漏”的结膜上皮，方便调节细胞旁转运[13]。交感神经能够刺激结膜鳞状上皮细胞复层，对于杯状细胞的作用不明，而副交感神经能够刺激杯状细胞分泌，对于旁边的复层鳞状上皮细胞没有明显影响。生长因子、乙酰胆碱、组胺和前列腺素能够刺激杯状细胞来源的黏蛋白，而对于结膜上皮细胞的作用不清楚[14，15]。因此，结膜中不同细胞的特异性分化及功能调节，仍然需要大量的研究工作来阐明。

之前的研究表明，结膜细胞谱系与角膜上皮谱系并不完全相同，结膜杯状细胞是有增殖能力的慢循环细胞，在穹窿区杯状细胞和角化细胞拥有共同的双能祖细胞，这些提示杯状细胞可能存在前体细胞或干细胞，这些具有干细胞特性的细胞群在眼表广泛分布，但在内眦部和下穹窿区更密集[16，17]。在角膜缘干细胞缺乏中，能够观察到含有不同数目的增殖细胞、慢循环角膜祖细胞和有丝分裂后杯状细胞的复合体从角膜缘区域向角膜中央迁移，最终在眼表形成更多的杯状细胞[18]。因此，为了更好研究及改善干眼的治疗，有必要寻找可靠的杯状细胞干细胞标记物，以及杯状细胞分化的调控机制。

二、干眼对杯状细胞的影响

干眼中眼表长期存在炎症反应，会导致结膜杯状细胞数量的减少，同时黏蛋白MUC5AC和其他杯状细胞的产物也同等比例的减少[19]，且杯状细胞的减少与炎症反应程度呈正相关，杯状细胞的丢失也与OSDI量表测量的眼表刺激症状呈正相关[24]。但到目前为止，干眼炎症反应导致杯状细胞减少的确切机制还不完全清楚。在兔干眼模型中，去除干眼诱导因素，杯状细胞的减少和其他干眼体征仍然持续了两周[20]。TNF-α、IFN-γ等炎症因子是导致杯状细胞数量和分泌减少的关键因子[21]。相反，暴露于过敏环境中能够刺激杯状细胞的存活、增殖和分泌。组胺、白介素、前列腺素和其他过敏因子刺激了黏蛋白的分泌，但具体机制也不完全清楚[22]。通过转录因子SPDEF，自然杀伤T细胞来源的IL-13能够上调杯状细胞的数量，诱导杯状细胞分化[23]。在部分干眼模型中发现，泪液的高渗透压也造成了结膜杯状细胞的丢失。这些研究表明，对于不同的外部环境和特定物质的刺激，结膜杯状细胞的反应并不相同。

Th1细胞、NK细胞和单核-巨噬细胞来源的IFN-γ能够引起杯状细胞分泌功能障碍，诱导未折叠蛋白反应，进而导致杯状细胞的凋亡[25，26]。在泪液缺乏性干眼，特别是Sjögren综合征中，可以发现结膜中IFN-γ以及其诱导的趋化因子CXCL-10的增加，同时泪液中IFN-γ等细胞因子的浓度也明显升高[27，28]。研究还表明，在免疫缺陷小鼠中，转移的CXCR3+CD4+ T细胞由于眼表干燥压力产生的IFN-γ，引起杯状细胞的广泛死亡。APC细胞导致泪液中IL-12增加，刺激T细胞和单核-巨噬细胞产生IFN-γ，IFN-γ介导趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11等，导致结膜杯状细胞丢失，从而形成一个自增强的炎症循环。

临床前期的研究表明，能够抑制干眼、减少细胞因子和炎症反应的治疗方法，也能够增加结膜杯状细胞的密度。FDA批准的CsA三期临床试验发现，CsA治疗水样缺乏性干眼6个月后，结膜杯状细胞的密度明显增加，Sjögren's综合征患者中增加198%，非Sjögren's综合征患者中增加234%[29]。糖皮质激素(氟米龙)和维生素A治疗干眼的临床研究中，也发现了结膜杯状细胞密度的增加[30，31]。FDA最新批复的治疗干眼新药，LFA-1拮抗剂立菲斯特，在小鼠干眼模型中也发现能够增加结膜杯状细胞的密度，但在人类的临床试验中尚无类似的研究报道[32]。

年龄一直是干眼的危险因素之一，大的流行病学调查显示，50岁之后，男性和女性干眼的发病率显著提高，尤其以女性显著[33，34]。相关的年龄改变包括泪河高度、泪液中炎症因子增加、角膜神经密度降低等，同时多个组织中炎症标记物IL-6、TNF-α和IFN-γ等也随着年龄增加，称之为炎性老化[35，36]。这些炎症介质中，IFN-γ因为能够促进角膜、结膜和泪腺的凋亡而显得尤为重要。在老化的小鼠结膜中，发现了CD4+ T细胞的增加和杯状细胞的减少，而在IFN-γ缺陷小鼠中，与年龄相关的杯状细胞的丢失明显减少了[37，38]。老化结膜中其他的危险因素还包括APC细胞的启动、病理性Th1细胞等，这些都引起年龄相关的杯状细胞的减少。

三、干眼中黏蛋白的改变

干眼中结膜杯状细胞的丢失首先引起黏蛋白分泌的减少。干眼患者的泪液中，黏蛋白MUC5AC的浓度降低，但研究显示干眼患者中MUC5AC基因的表达没有变化或者上升了[39，40]，这种差异主要源于干眼的严重程度不同。基因表达的上调可能是对黏蛋白分泌下降的代偿性调节，但也有研究注意到，干眼患者中MUC2基因表达下调了。在干眼病理过程中，也发生了黏蛋白糖基化的改变，在一部分没有干眼体征但有干眼症状的患者中有黏蛋白MUC2和MUC5AC糖基化的改变，MUC2和MUC5AC在维持泪液流体力学特性中发挥关键作用[41，42]。

在干眼患者中，还发现了膜相关黏蛋白基因MUC1、MUC4和MUC16表达的降低。这些黏蛋白是糖萼的主要成分，其表达的减少会导致眼表保护功能降低，眼表润滑作用也会相应降低[43，44]。MUC1糖基化的改变，在轻到中度患者中，主要表现为MUC1唾液酸化增加，而在重度患者中，主要表现为MUC1唾液酸化减少[45]。

研究发现，Sjögren’s综合征患者中，MUC5AC基因表达降低，同时泪液中MUC5AC的浓度也下降了，还有报道发现Sjögren’s综合征中的MUC19基因表达和终产物也下降了[46]。另一方面，Sjögren’s综合征患者中泪液中可溶性MUC16的浓度升高了，但结膜组织中膜结合MUC16没有明显变化[47]。而有研究显示，无论泪液中可溶性MUC1还是结膜组织中膜结合MUC1，在Sjögren’s综合征患者中都增加了[48]。研究者认为无论黏蛋白MUC1还是MUC16的升高都是一个代偿反应，这样可以维持干眼状态下眼表的功能。

四、促进杯状细胞恢复的方法

在结膜或杯状细胞遭受损害后，自体健康结膜组织移植是恢复眼表和结膜功能的一个理想方法，但很多时候并不可行，于是研究者一直在寻找其他可替代的粘膜组织移植。口腔粘膜易于获取，但其不含杯状细胞，不利于泪膜恢复。羊膜组织具有很好的抗炎作用，而且有利于结膜上皮化，广泛应用于眼表重建。结膜细胞目前可以在体外支架材料上培养，这为严重的结膜损伤患者提供了移植材料。结膜下成纤维细胞和上皮细胞共培养，促进了结膜祖细胞的生长。在角膜缘干细胞缺乏时，往往也伴有杯状细胞的大量丢失，此时自体或亲属的角膜缘组织移植可以提供大量的角膜缘干细胞。在炎症诱导的干眼模型中，眶周注射间充质干细胞后，眼表炎症因子的表达和CD4+ T细胞的浸润减少了，而泪液分泌和杯状细胞的数量增加了[49]。

研究发现，溶解素能够终止干眼中的炎症反应，调节杯状细胞分泌黏蛋白，因此可能成为治疗干眼的一个新的方向[50]。溶解素D1通过磷脂酶A2、C、D，ERK1/2，钙离子/钙调蛋白促进杯状细胞分泌，保护黏蛋白层，维持眼表稳态[51]。溶解素D2能够上调cAMP，增加细胞内钙离子浓度，促进杯状细胞分泌功能[52]。溶解素D1和E1能够阻止钙内流，活化ERK1/2，控制炎症环境中白三烯对杯状细胞分泌的刺激[53]。这些研究都表明，溶解素可能成为杯状细胞有效的调节剂，值得进一步关注。

Notch信号通路在肠道上皮分泌型或吸收型细胞的形成过程中起着决定性作用，可以通过信号通路引导细胞向特定方向分化，诱导结膜存在的干细胞向杯状细胞分化，从而增加结膜杯状细胞的数量。通过阻断Notch级联反应，导致小肠中增殖性的隐窝细胞向有丝分裂后的杯状细胞转变[54]。在肠道或结膜中条件性地去除Notch调节转录因子KLF4后，杯状细胞就停止发育了[55]。而抑制Notch信号通路可以增加KLF4的表达、促进杯状细胞分化以及减少肿瘤浸润和增生，说明Notch信号通路和KLF4存在相互调控[56]。通过上述结果可以预测，抑制结膜上皮细胞的Notch信号通路将促进杯状细胞的形成。需要注意的是，在角膜上皮细胞不可逆的失活Notch-1后，导致了角化增生，形成了一个血管化的不透明斑块[57]。

近期有报道称在小梁切除造成的结膜损伤中，活化CXCR3趋化因子受体增加了结膜杯状细胞的数量，手术后在兔眼结膜下注射活化的趋化因子也增加了杯状细胞的数量。杯状细胞增加的具体机制还没有阐明，但可能与两方面有关，一是直接作用于杯状细胞前体细胞，二是通过调节炎症微环境产生间接作用，因为白内障术后抑制炎症反应可以保留更多的杯状细胞[58]。M1型巨噬细胞产生CXCR3的配体CXCL10，是应对损伤的生理反应之一，能够在炎症早期或者死亡配体存在的情况下保护前体细胞或干细胞[59]。尽管这方面研究尚浅，但也说明控制干眼的炎症反应将有效挽救杯状细胞。

五、小结

随着研究深入，杯状细胞在干眼中的作用受到更多重视。不仅其分泌的黏蛋白是组成泪膜的重要成分，而且杯状细胞还发挥着调节炎症反应、促进细胞间物质转运等作用。虽然干眼中各种机制会导致结膜杯状细胞的丢失、分泌黏蛋白的减少，以及分泌的黏蛋白发生糖基化改变，加剧了干眼的恶性循环。但杯状细胞前体细胞存在的可能性，和提高杯状细胞数量的实验基础，为挽救杯状细胞提供了理论依据。结膜组织、角膜缘组织或各种干细胞移植，发挥溶解素对杯状细胞的调节作用，调控杯状细胞分化的信号通路，改善眼部炎症反应微环境等方法，都将成为未来治疗干眼的可能方向。