颅内动脉瘤患者手术前后血清miR-126、miR-125b表达变化及其临床意义

鄢 伟，王静静，李晓东

颅内动脉瘤是引起蛛网膜下腔出血的重要原因，具有较高的致残率和病死率[1-2]。因此，研究颅内动脉瘤的病理生理机制，对预防颅内动脉瘤具有重要意义。相关研究显示，血管生成、细胞外基质合成及降解与颅内动脉瘤的发生密切相关[3]。而血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是关键调节因子。microRNA(miRNA)是非编码小分子RNA，可调控靶基因的表达[4]。miR-126基因位于9q34.3，可调节血管内皮细胞功能[5]。另外，血管平滑肌细胞异常可引起血管壁重塑，导致动脉瘤发生[6]。研究发现，miR-125b能调控血管平滑肌细胞表型转化，与动脉瘤发生相关[7]。也有基础研究发现，miR-126、miR-125b可通过调控VEGF及MMP-9参与疾病的发生[8]。但二者在颅内动脉瘤患者外周血中的表达及与临床特征、预后、VEGF、MMP-9关系的报道较少，因此本研究对此进行分析，旨在为临床治疗提供参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年8月—2020年8月于我院行手术治疗的104例颅内动脉瘤的临床资料，并设为观察组，其中男60例，女44例；年龄35～80(42.16±5.77)岁。①纳入标准：均符合颅内动脉瘤诊断标准[9]，并经脑血管造影确诊；年龄30～80岁；既往无手术或药物治疗史，且颅内动脉瘤未破裂；临床资料完整。②排除标准：合并严重器质性疾病者；合并恶性肿瘤者；有严重头部外伤史；临床资料不完整。对观察组进行6个月的随访，根据不同预后分为生存组86例和死亡组18例。另选取同期进行体检的健康者100例作为对照组，其中男62例，女38例；年龄35～75(41.98±5.70)岁。观察组和对照组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准执行。

1.2方法

1.2.1治疗方法：颅内动脉瘤患者均行显微镜外科手术治疗，取平卧位，暴露穿刺部位，取单侧翼点入路，显微镜下解剖外侧裂池，导出脑脊液，显露载瘤动脉，细心解剖瘤颈，采用动脉瘤夹夹闭动脉血管；可临时阻断处理载瘤动脉，0.9%氯化钠注射液冲洗脑池，罂粟碱明胶海绵包裹载瘤动脉。手术完成后及时中和肝素，给予10 mg/100 ml尼莫地平注射液2～3 ml/h持续静脉泵入24 h，连续用药2周。同时采用我院自行设计的调查表收集患者一般资料。

1.2.2血清miR-126、miR-125b表达测定：观察组入院后第1天和术后第7天采集晨起空腹静脉血5 ml，对照组采集体检日晨起空腹静脉血5 ml，均以4000 r/min离心10 min，留取上清-80 ℃冰箱保存。取200 μl样品，应用Trizol法提取血清中总RNA，用异丙醇沉淀总RNA后75%乙醇洗涤，8000 r/min离心5 min，弃上清，室温干燥，50 μl的DEPC水溶解，NaroDrop检测RNA溶液的浓度及纯度，OD260/OD280为1.8～2.1。以总RNA为模板，逆转录合成cDNA，反应条件：37 ℃ 16 min，84 ℃ 6 s。qRT-PCR总反应体系20 μl，模板cDNA 1 μl，Taq聚合酶0.2 μl、正向及反向引物各1 μl、2×SYBRGreenmix 1 μl及20 mmol/L的dNTPs 1 μl，无RNA酶水14.8 μl。反应条件：96 ℃ 2 min，96 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，70 ℃ 10 s，共40个循环。miR-126引物正向：5'-ACACTCCAGCTGGGTCGTACCGTGAGTAAT-3'，反向：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCATTAT-3'；miR-125b引物正向：5'-GCCGTAAAGTGCTGACAGT-3'，反向：5'-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3'；内参基因U6引物正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向：3'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5'。结果采用相对定量法表示，目的基因miR-126、miR-125b的表达分别采用2-ΔΔCt法计算。

1.2.3血清MMP-9、VEGF水平测定：采用酶联免疫吸附试验检测血清MMP-9、VEGF水平，试剂盒由北京博尔迈生物技术有限公司提供，严格按照说明书进行操作。

1.3观察指标 ①记录观察组手术前后及对照组血清miR-126、miR-125b表达及VEGF、MMP-9水平；②观察术前血清miR-126、miR-125b表达与临床特征的关系；③记录生存组和死亡组术后血清miR-126、miR-125b表达水平；④分析术前血清miR-126、miR-125b与VEGF、MMP-9的相关性。

2 结果

2.1血清miR-126、miR-125b表达比较 观察组术前和术后血清miR-126表达均高于对照组，miR-125b表达均低于对照组(P<0.05)；观察组术后血清miR-126表达低于术前，miR-125b表达高于术前(P<0.05)。见表1。

表1 颅内动脉瘤患者和健康者两组血清miR-126、miR-125b表达比较

2.2血清VEGF、MMP-9水平比较 观察组术前和术后血清VEGF、MMP-9水平均高于对照组(P<0.05)；观察组术后血清VEGF、MMP-9水平低于术前(P<0.05)。见表2。

表2 颅内动脉瘤患者和健康者两组血清VEGF、MMP-9水平比较

2.3术前血清miR-126、miR-125b表达与颅内动脉瘤患者临床特征关系 术前血清miR-126、miR-125b表达与年龄、性别、动脉瘤形态、动脉瘤位置无明显关系(P>0.05)，而与动脉瘤数目、动脉瘤直径有关(P<0.05，P<0.01)。见表3。

表3 术前血清miR-126、miR-125b表达与颅内动脉瘤患者临床特征关系

2.4不同预后颅内动脉瘤患者术后血清miR-126、miR-125b表达比较 生存组术后血清miR-126表达低于死亡组，miR-125b表达高于死亡组(P<0.01)。见表4。

表4 不同预后颅内动脉瘤患者术后血清miR-126、miR-125b表达比较

2.5术前血清miR-126、miR-125b表达与VEGF、MMP-9的相关性 颅内动脉瘤患者术前血清miR-126表达与VEGF、MMP-9呈正相关(r=0.381、0.369，P均<0.001)，miR-125b表达与VEGF、MMP-9呈负相关(r=-0.364、-0.405，P均<0.001)。见图1。

3 讨论

miRNA可调控人体的生长发育，且由于其表达稳定，已成为重要的生物学标志物[10]。研究发现，颅内动脉瘤患者存在异常miRNA表达谱，且生物学信息表明，miRNA可通过调节内皮细胞凋亡、平滑肌细胞增殖和迁移等方式参与颅内动脉瘤的发病机制[11]。miR-126可调控血管细胞黏附分子的表达，并影响血管内皮细胞增殖，参与血管生成和重塑[12]。本研究结果显示，观察组术前血清miR-126表达高于对照组，表明miR-126可能参与颅内动脉瘤发生发展，原因为颅内动脉瘤可促进血管生成，进而使miR-126高表达。miR-125是高度保守的miRNA家族，其异常表达与炎症、免疫等密切相关[13]。研究表明，miR-125b在腹主动脉瘤中表达下调[14]。本研究结果显示，观察组术前血清miR-125b表达低于对照组，考虑与长链非编码RNA对miR-125b的抑制作用有关。另外，观察组术后血清miR-126表达低于术前，miR-125b表达高于术前，提示手术治疗可改善患者血清miR-126、miR-125b表达。同时本研究显示，观察组血清miR-126、miR-125b表达与动脉瘤数目、动脉瘤直径有关，其原因可能是颅内动脉瘤使miR-125b表达降低，导致MMP-9水平升高，MMP-9降低颅内动脉血管弹性，进而导致动脉瘤数目、直径增大；miR-126可促进VEGF生成，从而降低动脉血管弹性，导致动脉瘤数目和直径增大。本研究还发现，生存组术后血清miR-126表达低于死亡组，miR-125b表达高于死亡组，提示术后血清miR-126、miR-125b表达可为预后评估提供参考。

目前，有学者认为颅内动脉瘤是由动脉血管壁缺陷和颅内压增高引起的[15]。GUO等[16]研究发现，VEGF、MMP-9参与颅内动脉瘤的发生。MMP-9高表达会加速细胞外基质降解，导致血管外膜纤维连接薄弱，加速动脉瘤形成。VEGF可促进MMP-9激活，并引起尿激酶型纤溶酶表达上调，进而发挥促细胞外基质降解作用[17-18]。本研究显示，观察组术前血清VEGF、MMP-9水平高于对照组，提示VEGF、MMP-9可能参与颅内动脉瘤发生；观察组术后血清VEGF、MMP-9水平低于术前，提示手术可改善患者血清VEGF、MMP-9水平。另外，Spearman相关分析显示，术前血清miR-126表达与VEGF、MMP-9呈正相关，miR-125b表达与VEGF、MMP-9呈负相关，提示血清miR-126表达升高和miR-125b表达降低均可升高VEGF、MMP-9。但本研究纳入样本量少且随访时间较短，可能影响结论，下一步将扩大样本量并延长随访时间，以期更好地为临床提供参考。

综上所述，血清miR-126、miR-125b在颅内动脉瘤患者中存在异常表达，且与动脉瘤数目、直径、预后及VEGF、MMP-9水平具有密切关联。