AID对激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞的影响△

孙志博，马中希，叶志伟，刘珍星，杨钟华，张山锋*

（1.武汉大学人民医院骨科，湖北武汉 430060；2.武汉市第四医院、华中科技大学同济医学院附属普爱医院骨科，湖北武汉 430034）

1 资料与方法

1.1 BMSCs分离

在获得患者知情同意与医院伦理委员会的批准后，在2018年8月—2019年12月选取因GC-ON⁃FH行全髋关节置换术的16例患者，GC-ONFH患者的纳入标准为：服用糖皮质激素≥1 800 mg，时间≥4周。其中8例男性，8例女性，年龄61～69岁，平均（64.35±5.17）岁；和16例股骨颈骨折患者，7例男性，9例女性，年龄59～73岁；平均（67.25±6.32）岁。术中抽取股骨骨髓5 ml，将其缓慢倒入含等体积淋巴细胞分离液的离心管中，将离心获得白膜层的单个核细胞置于另一离心管内，用完全培养基悬浮并调整细胞密度，按一定密度接种，记作原代。每两天换液，细胞达90%融合时消化，按1∶2比例传代。

1.2 实验分组与基因转染

实验分4组，每组5例：A组（GC-ONFH源BMSCs）、B组（GC-ONFH源BMSCs经AID重组慢病毒转染）、C组（GC-ONFH源BMSCs经慢病毒空载体转染）、D组（股骨颈骨折BMSCs）。取第3代细胞，以转染倍数（MOI=25 pfu）行病毒转染，12 h后换液。以嘌呤霉素选择培养基筛选，约2周后获得抗性克隆细胞并大量扩增。与此同时，C组行空载体转染，转染倍数同前，D组行常规诱导。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 MTT检测

将细胞浓度调整为5×104/ml，接种至96孔板，每组各10孔，每孔加入完全培养基孵育过夜。在24、48、72 h的各个时间点分别每孔加入20 μl MTT溶液，在培养箱内放置4 h后弃上清，加进150 μl DMSO，酶联免疫检测仪记录各孔吸光值。

1.3.2 线粒体膜电位检测

线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）检测，在0.5 ml含有50万细胞的细胞悬液内，加入0.5 ml JC-1染色工作液，37℃孵育20 min。600 g 4℃离心10 min后弃上清。用JC-1染色缓冲液洗涤后，流式细胞仪测定相对荧光强度。

1.3.3 活性氧检测

活性氧（reactive oxygen species,ROS）检测，在离心后的细胞内加入10 μM DCFH-DA，使细胞密度为5.0×106/ml。利用流式细胞仪检测相对荧光强度，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。

在检测出发生周跳的历元后，利用Chebyshev多项式拟合算法对周跳进行修复。修复的具体过程为：先利用完好性监测算法探测出发生周跳的历元，然后利用Chebyshev多项式将附近没有发生周跳的载波相位数据进行拟合，计算出周跳的值。

1.3.4 亚硫酸氢盐检测

取 500 ng细胞 DNA，加双蒸水到 20 μl，行PCR：98℃ 10 min，64℃ 2.5 h，DNA 行纯化及脱硫。再次行PCR反应。通过2%琼脂糖凝胶电泳来鉴定扩增产物。以DNA回收试剂盒回收产物并测序。测序区域为：-760 bp～-407 bp，-328 bp～-55 bp。

1.3.5 Western blot检测

收集细胞，加入RIPA裂解液和PMSF，4℃12 000 r/min离心30 min，取上清。加入等体积的loading buffer，95℃孵育10 min后上样电泳。以P糖蛋白或 AID一抗（1∶500）和 GAPDH（1∶1000）孵育过夜。次日以HRP标记的二抗（1∶2000）于室温孵育1 h后曝光显像。

1.3.6 RT-qPCR检测

提取各组细胞的总RNA，行逆转录及荧光实时定量反应，使用2-△△Ct法对数据进行计算，重复3次。引物序列见表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量数据采用±s表示，资料呈正态分布时，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；资料非正态分布时，采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖检测

MTT检测结果见表2，随时间推移，4组细胞MTT检测的光密度（optimal density,OD）值均显著增加（P＜0.05）。相应时间点，D组的OD值明显高于A、B、C组（P＜0.05），而B组OD值显著高于A和C组（P＜0.05），但仍低于D组。A组与C组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 4组细胞MTT检测OD值（±s）与比较

表2 4组细胞MTT检测OD值（±s）与比较

时间点2 4 h A组（n=5）0.2 1±0.0 6 B组（n=5）0.2 6±0.0 4 C组（n=5）0.2 2±0.0 6 D组（n=5）0.3 2±0.0 5 P值＜0.0 0 1＜0.0 0 1 7 2 h P值0.3 3±0.0 6 0.0 1 3 0.4 2±0.1 1 0.0 1 5 0.3 2±0.0 7 0.0 4 1 0.4 5±0.0 9 0.0 2 2＜0.0 0 1

2.2 MMP检测

MMP检测结果见表3。D组线粒体膜电位明显高于其他组（P＜0.05）。B组线粒体膜电位较A、C组明显提高（P＜0.05），但仍低于D组。A、C组差异无统计学意义（P＞0.05)。

表3 4组细胞线粒体膜电位、ROS和亚硫酸氢盐检测结果（±s）与比较

表3 4组细胞线粒体膜电位、ROS和亚硫酸氢盐检测结果（±s）与比较

2.3 ROS检测

ROS结果见表3。D组的ROS水平显著低于其他各组（P＜0.05）。B组的ROS水平较A、C组显著降低（P＜0.05），但仍显著高于 D 组（P＜0.05）。A、C组差异无统计学意义（P＞0.05)。

2.4 亚硫酸氢盐检测甲基化率

亚硫酸氢盐测序结果见表3。在选定的两个甲基化岛区域内（-760 bp～-407 bp，-328 bp～-55 bp），D组ABCB1基因启动子区甲基化率显著低于A、C组（P＜0.05）。过表达AID后，B组ABCB1启动子区甲基化率较A、C组明显降低（P＜0.05），接近于D组水平（P＞0.05）。

2.5 Western blot检测

Western blot检测结果见图1。4组图像经Image Pro Plus 6.0软件检测AID蛋白含量的OD值，A组为（0.24±0.03），B 组为（0.61±0.04），C 组为（0.22±0.03），D组为（0.79±0.05）。B组显著高于A组及C组（P＜0.05），稍低于D组。

图1 4组细胞AID及P-gp蛋白表达的Western blot检测结果。结果显示B组的AID蛋白表达显著高于A组及C组，稍低于D组。D组P糖蛋白表达显著高于A、B、C 3组，B组P糖蛋白表达显著高于A和C组，接近D组水平。这表明ONFH患者BMSCs中AID、P-gp表达显著下调，AID过表达可明显提高P糖的水平

P糖蛋白（P-glycoproteins,P-gp）蛋白含量的OD 值，A 组为（0.17±0.01），B 组为（0.46±0.04），C 组为（0.20±0.01），D 组为（0.54±0.04）。D 组 P-gp蛋白表达量显著高于其他三组（P＜0.05），而B组P-gp蛋白表达量显著高于A和C组（P＜0.05），接近D组水平。

2.6 RT-qPCR检测

RT-qPCR检测结果见表4。B组AID mRNA表达量显著高于A组和C组，高达7倍（P＜0.05），接近D组水平（P＞0.05）。B组ABCB1 mRNA表达量显著高于A组和C组（P＜0.05），但与D组比较差异无统计学意义（P＞0.05)。

表4 四组细胞AID和ABCB1 mRNA表达RT-qPCR检测结果（±s）与比较

表4 四组细胞AID和ABCB1 mRNA表达RT-qPCR检测结果（±s）与比较

images/BZ_64_207_393_498_461.pngimages/BZ_64_498_393_847_461.pngimages/BZ_64_847_393_1266_461.pngimages/BZ_64_1266_393_1668_461.pngimages/BZ_64_1668_393_2016_461.pngimages/BZ_64_207_528_498_595.pngAID mRNA images/BZ_64_498_528_847_595.png1.0 0±0.1 0images/BZ_64_847_528_1266_595.png7.8 3±0.9 4images/BZ_64_1266_528_1668_595.png1.6 2±0.2 2images/BZ_64_1668_528_2016_595.png8.5 4±1.0 6 P值＜0.0 0 1＜0.0 0 1

3 讨论

AID作为一种RNA编辑脱氨酶，参与了DNA/RNA编辑，B淋巴细胞免疫球蛋白基因的种类转变重组和体细胞的超突变过程[1-3]。它通过将脱氧胞嘧啶转化成脱氧尿嘧啶，修改靶基因序列从而促进人体第二抗体的多样化[7，8]。已知AID的高表达与肿瘤的发生发展密切相关[9]。近年来AID被发现具有很强的去甲基化功能[10]，它在体细胞DNA甲基化再编程及其多能性诱导和维持过程中起着十分重要的作用[11]。本课题组前期研究证实：表观遗传调控在激素性股骨头坏死的发病过程中起着很重要作用[6]，ABCB1基因的过甲基化修饰，使得P糖蛋白合成减少，通过一系列生理生化过程导致BMSCs功能失调[5]。然而诱发激素性股骨头坏死BMSCs基因组DNA过甲基化修饰的始动因素尚不清楚。为此，本研究通过对比AID在激素性股骨头坏死组与对照组的表达水平，构建AID重组慢病毒载体并转染BM⁃SCs，观察细胞的增殖能力、线粒体膜电位、细胞内ROS水平及ABCB1基因启动子区甲基化的动态变化，明确AID表达水平、ABCB1基因甲基化程度与BMSCs功能失调三者之间的关系，以期为该病的防治提供新的靶点。

作者通过实时定量PCR、Western blot、亚硫酸氢盐测序等方法，在基因和蛋白质水平上证实了激素性股骨头坏死患者的BMSCs中AID、ABCB1表达显著降低，ABCB1基因启动子区甲基化水平增高；过表达AID能明显地降低ABCB1基因甲基化水平，促进ABCB1表达与细胞增殖，同时恢复细胞内线粒体膜电位及ROS水平，以上表明激素性股骨头坏死疾病中AID表达受抑制，使得细胞处于过甲基化修饰状态，抑制了ABCB1基因表达从而产生一系列病理生理改变，最终导致细胞功能失调。

越来越多的研究表明，糖皮质激素诱发的BM⁃SCs氧化应激损伤与激素性股骨头坏死的发生发展密切相关[12-14]。高剂量的糖皮质激素可诱发成骨细胞内的氧化应激反应以及线粒体的功能变化[15，16]。处于严重的氧化应激状态下，细胞内蓄积过量的活性氧会引发内质网应激，线粒体DNA受损，线粒体功能失调，最终激活凋亡通路，诱发成骨细胞凋亡，最终导致股骨头坏死的发生[17]。有研究显示抗氧化剂可通过降低细胞内的活性氧水平有效地防治激素性股骨头坏死的发生发展[18，19]。因此，细胞内的活性氧含量及氧化应激状态在激素性股骨头坏死的发生发展中起着重要作用，是治疗上的关键环节。本实验中，作者发现过表达AID后细胞的增殖能力、线粒体膜电位水平、细胞内活性氧水平均得到了显著性恢复，这也提示AID可有效地抑制细胞内氧化应激状态，改善细胞功能。通过上述结果，作者认为AID可能通过降低基因组ABCB1基因的甲基化水平，提高其表达，促使P糖蛋白合成增多，从而将细胞内蓄积的糖皮质激素加快排出，降低细胞内氧化应激水平，恢复细胞的正常生理功能。

综上所述，本实验发现了激素性股骨头坏死患者BMSCs中AID表达显著性下调，使得ABCB1呈过甲基化修饰状态，抑制了P糖蛋白的合成与分泌；AID过表达能有效地降低其甲基化水平并改善细胞功能。本研究为激素性股骨头坏死的发病机制和临床诊治提供了新思路。