早期高压氧联合康复治疗对脑出血自噬蛋白Beclin-1的影响

王风波，唐明薇，王科，王琼芬，王宝兰

脑出血患者往往遗留严重的神经行为功能障碍，活动能力低下，社会参与受限，给其家庭和社会带来一定的负担[1]。自噬是真核细胞自我分解代谢蛋白质、衰老细胞器并再利用的重要途径，以维持机体平衡和生存[2]。研究显示，多种中枢神经系统疾病的发生发展均有自噬的参与，其表现为活性及相关基因的异常表达，如缺血缺氧性等脑损伤，自噬的激活可明显降低神经细胞死亡率，被视为自噬机制对神经细胞的保护作用[3]。Beclin-1是主要自噬标记物之一，不但是衡量自噬活性或水平的重要方法，而且对自噬过程及程度的调节起着重要作用。本研究采用高压氧联合早期康复训练对脑出血大鼠进行干预，观察大鼠海马区脑细胞Beclin-1阳性表达及神经行为学的变化，旨在探讨高压氧联合早期康复训练对脑出血后自噬相关蛋白活性的影响作用，以及自噬相关蛋白活性与神经行为学改变的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物与分组：健康成年雄性SD大鼠55只，体质量240～280g，由成都医学院动物实验中心提供[SYXK(川)2015-196]，按随机数字表法分为空白组、非干预模型组、高压氧组、康复训练组、联合干预组，每组各10只，备用大鼠5只。所有大鼠均常规饲养，实验过程遵循国家有关实验动物使用准则。②主要仪器及试剂：小动物颅骨钻、脑立体定位仪(玉研科技)，高压氧实验舱(烟台宏远)，Ⅶ型胶原酶、Beclin-1兔多克隆抗体及链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex，SABC)试剂盒(武汉博士德)、山羊抗兔工作液(北京中杉金桥)、数码三目摄像显微镜(麦克奥迪)、图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics)。

1.2 方法 ①脑出血模型制备：称重后腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，头部向上固定于脑立体定位仪，前囟区备皮，消毒，钻孔定位左侧尾状核：前囟后1.0mm矢状线左侧3mm处，颅骨钻钻孔后进针5mm，微量注射器设置5min，缓慢注入胶原酶Ⅶ型溶液0.5U，留针10min，缓慢退针[4]。实验过程中保持室温25±2℃。空白组不予任何处置。模型制备成功标准：术后次日，大鼠清醒，神经行为学Longa评分≥2分。②干预方法：a.高压氧：术后第3天开始，高压氧组、联合干预组大鼠每天按时置入高压氧实验舱，先纯氧洗舱10min至舱内氧浓度达(90±2)%，20min匀速加压，至2.0个绝对大气压后稳压吸纯氧40min(氧流量2L/min)，再20min匀速减压出舱[5]。1次/d，连续14d。空白组、模型组大鼠不予高压氧干预。b.早期康复训练：术后第3天开始，康复训练组、联合干预组大鼠进行以下训练[6]：细毛牙刷从头至尾匀速刷动；网屏训练在尺寸60×60cm，网格1cm2，距地面约50cm处，训练大鼠四肢抓握；跑笼为圆形，直径40cm，内径8cm，训练大鼠笼内奔跑；平衡木的尺寸120cm×4cm，水平置于地面上方40cm处，训练大鼠在平衡木上行走，下方铺以软垫保护大鼠。所有训练均10min/次，1次/d，连续14d。空白组、模型组大鼠不予任何康复训练。

1.3 评定标准 ①神经行为学Longa评分：4分为神经功能严重受损，自发行走能力缺失；3分为向对(右)侧倾倒，行走困难；2分为行走时向对侧转圈；1分为不能充分伸展对侧上肢，但可自由行走；0分为无神经功能缺失症状[7]。②免疫组织化学Beclin-1检测：干预7d及14d，Longa评分结束后，每组随机各取5只大鼠麻醉后断头取脑，4%多聚甲醛液固定，右侧海马区脑组织石蜡包埋切片，每例组织取4张厚度约5μm切片。采用SABC法行免疫组织化学Beclin-1检测：切片按步骤磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗及滴加山羊血清封闭液，室温20min，滴加一抗(兔多克隆抗体，工作浓度1∶100)，4℃过夜，滴加生物素化二抗，37℃ 30min，PBS水洗3次，每次5min；PBS代替一抗为阴性对照，二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色[8]。光镜下阴性细胞呈蓝色，底物呈白色，阳性细胞呈黄色或棕黄色，Beclin-1阳性产物主要分布在细胞质及细胞间质。每张切片400倍光镜下随机选取4个视野，视野互不叠加，采集阳性细胞图像的光密度(optical density，OD)，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定所采集全部图像的光密度和面积，计算每张图像的平均光密度(average optical density，AOD)，并得出每例样本的平均光密度。

2 结果

2.1 神经行为学Longa评分 造模大鼠死亡及Longa评分<2分各1只，剔除后随机补充2只大鼠，以相同方法造模成功。干预7d和14d后，高压氧组、康复训练组、联合干预组大鼠Longa评分较非干预模型组同时间点比较均明显下降(均P<0.05)，康复训练组和联合干预组较高压氧组组同时间点比较，Longa评分均更低(均P<0.05)，联合干预组较康复训练组同时间点比较，Longa评分均更低(均P<0.05)。干预14d后，高压氧组、康复训练组、联合干预组的Longa评分均较干预7d时更低(均P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠Longa评分比较 分，

2.2 免疫组化检测情况 如图1，干预7d和14d后，非干预模型组大鼠右侧海马区脑细胞Beclin-1阳性反应较空白组同时间点比较均显著增强(均P<0.01)，高压氧组、康复训练组、联合干预组大鼠脑Beclin-1阳性反应较非干预模型组同时间点比较均明显下降(均P<0.05)，联合干预组的下降幅度均大于高压氧组和康复训练组(均P<0.05)，高压氧组与康复训练组之间比较差异无统计学意义。干预14d后，高压氧组、康复训练组、联合干预组Beclin-1表达水平均较干预7d时进一步下降(均P<0.05)。见表2。

a.非干预模型组(细胞质及间质阳性反应显著增强) b.高压氧组(阳性反应下降)

c.康复训练组(阳性反应下降) d.联合干预组(阳性反应显著下降)

表2 5组大鼠右侧海马区Beclin-1表达(AOD值)比较

3 讨论

Beclin-1蛋白包含有450个氨基酸序列，是对自噬的发生、发展起着重要的调控作用的相关基因，同时也是检测自噬程度的的主要标志因子之一[10]。本研究采用微量胶原酶Ⅶ型注入大鼠尾状核区域，模拟人脑出血病程，诱发脑出血，神经行为学Longa评分均≥2分，神经功能明显缺失，造模成功。相较空白组，模型组大鼠脑Beclin-1表达水平显著增强，提示脑出血后脑细胞自噬机制激活，且反应强烈。自噬是细胞依赖溶酶体途径的自我降解过程[11]，生理状态下对维持细胞内环境的稳态有重要作用[12]，在受到损伤、缺氧缺血等应激情况下，自噬机制启动可降解和清除受损的细胞器、蛋白质以维持正常细胞供能，提高细胞的抗损能力，一定程度上对细胞起着保护作用，但受到严重伤害性刺激而过度激活的自噬则可能促进细胞死亡，损伤机体[13]。近年来，自噬在神经系统疾病中的作用得到广泛研究和验证。有研究显示自噬在脑损伤过程中呈时间相关性作用，因溶酶体功能障碍所致的自噬体清除功能失常，与神经元的死亡密切相关[14]。缺血性脑损伤后自噬机制如受到破坏或抑制，会导致失活细胞器及蛋白质在细胞内积聚，引发神经元死亡，而内质网的应激反应和自噬机制的激活则有利于脑损伤的缓解[15]。有学者应用糖苷类药物干预大脑中动脉闭塞模型大鼠，抑制过度激活的自噬机制，减少神经元死亡，证实了通过抑制过度自噬可保护神经细胞[16]。

从造模后第3天开始，给予高压氧组、康复组、联合干预组大鼠高压氧治疗和(或)康复训练，时机上处于脑出血急性期，契合超早期康复理念。治疗进程中观察到大鼠的精神状态、反应力、活动、进食等逐步改善。高压氧干预方案参照了人类普遍治疗模式，即匀速加压至2.0个绝对大气压后稳压持续低流量吸纯氧40 min，再匀速减压，从入舱到出舱共80 min。结果显示，高压氧治疗7d和14d，高压氧组大鼠不但Longa评分均明显低于非干预模型组，而且右侧海马区脑细胞免疫组化Beclin-1阳性反应亦较非干预模型组明显降低。组内比较，14d的评分及检测结果优于7d。说明高压氧治疗可有效降低脑细胞自噬相关蛋白表达，调节过度激活的自噬机制，改善脑出血大鼠的神经行为学功能，两者呈正相关性，随着疗程的延长，治疗作用可进一步显著表现。高压氧调节脑细胞自噬机制可能与高压氧改善脑细胞氧代谢，清除氧自由基，抑制炎性及变态反应，调节脑微循环等有关[17-18]。

康复训练在脑出血的干预方面已有较多研究，大多应用于脑出血恢复期，此期病情稳定，相对较为安全，但在脑出血超早期介入的方面少有报道[19-21]。对处于脑出血急性期的大鼠予软毛刷本体感觉刺激、跑笼、平衡木及网屏等康复训练措施，40min/次，1次/d，全程无大鼠死亡或病情加重现象。训练7d和14d后，康复训练组大鼠Longa评分均明显低于非干预模型组，右侧海马区脑细胞Beclin-1阳性反应亦较非干预模型组明显下降，组内比较，14d的评分及检测结果优于7d。组间比较，康复训练组的Longa评分甚至优于高压氧组。说明脑出血超早期康复介入可安全有效地降低脑细胞自噬相关蛋白表达，调节过度活跃的自噬水平，改善神经行为学功能，两者呈正相关性，且随着康复介入进程，其治疗作用呈增强趋势。联合干预组大鼠在造模第3天开始，给予相同方案的高压氧和康复训练联合干预，干预7d和14d，联合干预组的Longa评分和右侧海马区脑细胞Beclin-1阳性反应均低于高压氧组和康复训练组，组内比较，14d同样优于7d，说明高压氧联合康复训练对脑出血超早期的干预模式，在调节脑细胞自噬相关蛋白表达，抑制脑细胞自噬机制过度激活和改善神经行为功能方面，均较单纯高压氧或康复训练具有更加明显的作用。

高压氧联合早期康复脑出血急性期的干预优势，在于将高压氧与早期康复训练的治疗作用有效结合，二者相互益彰，产生更大的协调促进效应，对神经行为功能的显著改善作用，可能与进一步调节脑细胞受损致过高的自噬水平有关。