谷氨酸受体-6基因多态性与阿尔茨海默病患者攻击症状相关性研究

张洪燕，张向荣，唐李李，周超，陆蓉

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是临床最常见的痴呆类型，严重影响患者日常生活及活动。AD患者除智能障碍外，常伴有精神行为症状，其中伴攻击行为总体患病率为40%。攻击症状不仅令患者的照料者感到痛苦，也与患者认知能力下降、独立性丧失和其他不良预后指标相关，增加患者住院风险，是AD治疗的重点目标之一[1-2]。

谷氨酸是大脑皮质和海马的主要兴奋性神经递质，在神经元发育和突触可塑性方面发挥重要作用，参与运动控制、学习和记忆、神经发育等[3]。突触前和突触后谷氨酸能系统的缺失和功能障碍与AD的认知功能障碍有关。研究[4]发现，离子型谷氨酸受体-6(GRIK2)基因敲除小鼠表现出更明显的冲动与攻击性及更少的抑郁样行为。GRIK2基因rs2227283多态性与酒依赖、精神分裂症、双相障碍患者的攻击行为均显著相关，而酒依赖患者的攻击行为与GRIK2基因rs6922753多态性也显著相关[5-7]。目前对AD攻击行为的遗传学研究发现主要集中在5-羟色胺系统、多巴胺系统、载脂蛋白E(APOE)，尚无有关AD患者的攻击行为和谷氨酸受体基因多态性之间的相关研究。

GRIK2基因位于6q16.3区域，分为17个外显子，覆盖约670 kb的区域。GRIK2有助于抑制性传递，调节兴奋性反应，在突触生理学中发挥重要作用。本研究分析中国汉族AD患者GRIK2基因rs9390757、rs9399721、rs2227283、rs2518220、rs2852576、rs995640、rs2518170、rs2245817、rs2518306、rs2518242、rs9498663共11个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与攻击行为之间的相关性。

1 对象和方法

1.1 对象

为2016年1月至2018年6月在本院老年精神科、南京市祖堂山社会福利院精神科住院的AD患者。入组者符合美国《精神障碍诊断和统计手册》第4版(DSM-Ⅳ)AD诊断标准；其攻击行为诊断参照国际老年心理协会(IPA)的标准：①发生在有认知障碍或痴呆综合征的患者中；②表现出与情绪困扰行为一致的行为；③表现出过度的运动活动、言语攻击或身体攻击；④行为必须造成人际关系、社会功能方面和/或执行或参与日常生活活动的能力的严重损害[8]。

排除标准：①患其他脑器质性疾病或精神疾病(如抑郁症)等影响判定认知功能损害性质的疾病；②有酒及其他精神活性物质滥用史。本研究经南京脑科医院伦理委员会批准，所有受试者或家属签署知情同意书。

入组AD患者88例，其中男32例，女56例；平均年龄(78.17±8.54)岁，平均病程(4.79±3.15)年。

1.2 方法

1.2.1 一般资料采集 对符合标准的入组患者采集一般资料，进行神经认知功能评估，抽取晨空腹上臂静脉血2 ml用以提取DNA并进行GRIK2基因SNP分析。

1.2.2 认知功能评估 认知评估由经培训的检查者在专设的标准化心理检查室进行，所有受试者均按照相同顺序测试。采用简易智力状态检查量表(MMSE)评估患者认知功能；采用柯恩-曼斯菲尔德激越情绪行为量表(CMAI)对入组者激越攻击行为评分。1986年英文版CMAI发表，用于评定痴呆症患者的激越情绪和行为；中文版CMAI引自夏仲等2005年《行为医学量表手册》；CMAI分为3个因子：躯体性攻击行为(13项)、躯体性非攻击行为(14项)、言语性激越行为(9项)。

1.2.3 GRIK2基因多态性检测 在HapMap数据库检索该基因的标签SNP，获得rs9390757、rs9399721、rs2227283、rs2518220、rs2852576、rs995640、rs2518170、rs2245817、rs2518306、rs2518242、rs9498663共11个SNP位点；PCR扩增目的片段：由上海天昊生物科技有限公司提取样本DNA后，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段。各SNP位点PCR扩增引物序列见表1。反应体系：20 μL，包含1×GC-I buffer(Takara)、3.0 mM Mg2+、0.3 mM dNTP、1U HotStar Taq polymerase(Qiagen Inc)、1 μL样本DNA和1 μL多重PCR引物。PCR循环参数：95 ℃变性 2 min，(94 ℃变性 20 s，65 ℃退火 40 s，每循环减0.5 ℃，72 ℃延伸90 s)×循环 11次，(94 ℃变性 20 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸90 s)×循环 24次，72 ℃延伸 2 min，4 ℃保温。多态性位点检测：在20 μL PCR产物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37 ℃温浴1 h,然后75 ℃灭活15 min。连接反应体系：10x 连接缓冲液 1 μL、高温连接酶 0.25 μL、5'连接引物混合液(1 μM)0.4 μL、3'连接引物混合液(2 μM)0.4 μL、纯化后多重PCR产物 2 μL、ddH2O 6 μL 混匀。连接程序：(94 ℃变性1 min，56 ℃退火并连接4 min)×循环38次，4 ℃保温。连接产物上ABI3730XL测序仪：取0.5 μL 稀释后的连接产物，与0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di 混匀，95 ℃变性5 min后上ABI3730XL测序仪，收集的原始数据用 GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems,USA)分析,获得扩增片段的基因序列。

表1 GRIK2基因各 SNP 位点PCR扩增引物

1.2.4 统计学方法 采用SPSS 20软件进行数据处理，Hardy-Weinberg平衡检验采用χ2吻合度检验；采用PLINK 1.9软件和加性遗传模型(Addictive model)对GRIK2基因SNP进行分析；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者年龄、病程、MMSE、CMAI评分相关性分析

Spearman相关分析显示，MMSE评分与病程呈负相关(r=-0.421，P<0.001)；CMAI评分与年龄、病程、MMSE评分无相关。见表2。

表2 AD患者年龄、病程、MMSE、CMAI评分相关性分析(r值)

2.2 遗传平衡性检验(Hardy-Weinberg检验)

经χ2吻合度检验，GRIK2基因rs2518242不符合H-W遗传平衡(P<0.05)，后续分析排除此位点；剩余10个位点rs9390757、rs9399721、rs2227283、rs2518220、rs2852576、rs995640、rs2518170、rs2245817、rs2518306、rs9498663符合H-W遗传平衡(P>0.05)，纳入后续分析。

2.3 GRIK2基因多态性与CAMI评分相关性分析

采用一般线性回归，以年龄、性别作为协变量，将CMAI评分作为因变量进行分析，统计结果进行FDR多重校正；rs9390757、rs9399721、rs2227283位点统计结果经过多重校正后仍有统计学意义(P均<0.05)；携带rs9390757 C等位基因、rs9399721 C等位基因的患者CMAI评分更高；携带rs2227283 A等位基因(β=-0.274,P<0.05)的患者CMAI评分更低。见表3。

表3 AD患者GRIK2基因多态性与CAMI评分相关性分析

3 讨论

AD患者攻击行为的发生机制仍未完全阐明。在神经生物学水平上，AD患者的攻击行为与眶额皮质和前扣带的神经纤维缠结密度增大、右额/颞叶和双侧扣带皮质代谢减退有关[9]。从遗传学角度来看，色氨酸(TRP)羟化酶基因A218C内含子多态性、5-羟色胺转运体(5-HTTVNTR)等位基因多态性、5-HTT启动子区域的5-HTTPR*L等位基因和*L/*L基因型、多巴胺受体1(DRD1)B2等位基因多态性、5-HT2A受体基因多态性(102T基因型)、APOE的e4等位基因与AD的攻击性之间存在相关性[10]。环境因素，如噪音、过度拥挤、缺乏空间和护理人员与患者之间缺乏沟通等，可能增加攻击行为发生的可能性[11]。总之，现有的证据表明，神经生物学、遗传学和环境因素相互作用，促使有易感性的AD患者表现出攻击性[12]。

本研究发现，AD患者的病程与MMSE评分呈负相关；提示病程越长，患者认知损害程度越重；CMAI评分与年龄、病程、MMSE总分间无明显相关，提示AD患者攻击行为可能是受到其他因素的影响。

本研究分析了中国汉族AD患者攻击行为与GRIK2基因rs9390757等11个SNP之间的相关性结果显示，rs9390757、rs9399721、rs2227283共3个位点SNP与CAMI评分相关，其中携带rs2227283 A等位基因的患者CMAI评分明显低于携带G等位基因的患者，提示rs2227283基因多态性可能与AD患者攻击行为相关，与既往对酒依赖和精神分裂症、双相障碍患者的研究结果相一致；但是，在他们的研究中，A等位基因是攻击行为的危险因素，而在本研究中，携带A等位基因的患者CMAI评分较低，提示A等位基因是中国汉族AD患者攻击行为的保护因素，两者差异可能与不同疾病中攻击行为的病理机制不同有关。rs2227283多态性如何影响攻击行为的机制尚不清楚，将在今后进一步研究。本研究发现携带rs9390757 C等位基因、rs9399721 C等位基因的患者CMAI评分更高，提示携带rs9390757 C等位基因、rs9399721 C等位基因可能是中国汉族AD患者攻击行为的危险因素。该发现不仅为AD患者攻击行为的遗传学研究提供了依据，也为其他精神疾病攻击行为的遗传学研究提供了更多的基因多态性位点筛选的可能。

综上所述，本研究结果显示GRIK2基因rs2227283、rs9390757、rs9399721基因多态性与AD患者攻击行为有相关性，GRIK2基因多态性是AD患者攻击行为易感性的潜在遗传机制之一。但本研究仍存在一些局限性：首先，样本量相对较小，不应排除假阳性结果的可能。其次，尽管这项研究发现rs2227283、rs9390757、rs9399721基因位点与AD患者的攻击行为相关，但其生物学机制仍不清楚。因此，有必要进行进一步的研究探讨确切的生物学机制。