载药缓释敷料对兔开放创面愈合的影响△

耿 磊，张国强，倪 明，任 鹏，刘 浩，孙菁阳，郑清源，程 龙，黄靖香

（中国人民解放军总医院骨科，北京 100853）

现代战争中枪弹伤占64.4%，爆炸伤占34.4%［1］，爆炸伤容易造成开放伤，常致软组织缺损、失血及创口感染。失血和感染是导致开放伤严重结局的重要因素。因此止血、抗感染是战场急救和后送要重点关切和解决的问题。一般来讲，在战场上处理开放伤的重要环节应包括伤口清洗、迅速止血、伤口敷料包扎、合理固定肢体及后送。本研究致力于改进伤口敷料的性能，这一环节要求继续巩固止血，并达到止痛，抗菌的效果。

研究较多的止血药物包括氨甲环酸、凝血酶原、壳聚糖等［2，3］，局部止痛的药物也较多，如利多卡因、罗哌卡因等。用于伤口表面抗感染的常用药物包括氧氟沙星、左氧氟杀星、纳米银等［4］。对于伤口包扎这一战创伤处理环节，本研究遴选出疗效确切的药物并通过可以缓释药物的载体，将这些药物有机的结合在一起。已知可生物降解的高分子聚合物可以作为药物缓释载体的有壳聚糖、聚乙烯醇、聚已酸内酯、聚乳酸羟基乳酸等［5～8］。壳聚糖/聚乙烯醇载药复合敷料的制备和性能已有较多研究，其载体的生物相容性较好，药物的体外释放和体内疗效均得到较多基础实验的验证［9］。但目前多数研究是载有一种药物，本实验研究了壳聚糖/聚乙烯醇载多种药物的制备以及对开放战创伤兔模型的疗效，采用了目前应用较多、较为成熟的静电纺丝技术［9］，对战创伤急救敷料的研制是一次改进。

1 材料与方法

1.1 载药敷料的制备

将壳聚糖（10万分子量）溶解在质量分数为2%的醋酸溶液中制备成壳聚糖质量分数为7%的溶液,加入质量分数为10%聚乙烯醇蒸馏水溶液，mCS/mPVA为4/6。再加入氨甲环酸、罗哌卡因以及纳米银，此三种药物按照质量等比配比，总质量为混合溶液质量的2%～5%，在25 kV静电压，0.77 mm的喷丝孔，喷丝口距接收板为10 cm的条件下通过静电纺丝制备纤维膜，在质量分数为1.25%的戊二醛溶液中进行交联1 h后在通风箱内干燥24 h。

1.2 实验动物分组

成年健康日本大耳白兔16只，雌雄不限，体质量（3.05±0.41）kg，由解放军总医院动物实验中心提供，实验动物均适应性饲养1周。进行随机分组，每只大耳白兔有一编号，随机分组编号由电脑生成，由实验人员分别装入封闭信封，需要实施治疗时打开。

1.3 模型制备与创面处理

选择大耳白兔16只，将其右下肢广泛备皮，在右大腿外侧造成人工创面，创面形状为圆形，直径为2 cm，圆形内部切除0.5 cm深的组织，切除的组织包括皮肤、皮下及肌肉组织。创面给予泥沙污染静置3 h后进行清创术。新型敷料组给予新型敷料并包扎，每2 d更换一次新型敷料，传统敷料组给予无菌纱布包扎，每2 d换药一次，用碘伏消毒伤口。

1.4 评估方法

1.4.1 载药敷料体外药物释放测定方法

通过分光光度法测定载药壳聚糖/聚乙烯醇纤维膜在生理盐水中体外释放氨甲环酸、罗哌卡因及纳米银的浓度［10］。分别取一定量氨甲环酸、罗哌卡因及纳米银，分别将其完全溶解在蒸馏水中，配置成0.1 mg/L的溶液，取蒸馏水作为空白溶液，使用紫外分光光度计进行扫描，分别测出三种药物的最大吸收峰波长，通过药物不同浓度与对应吸光度的数值计算出药物浓度与吸光度的线性方程。通过此方程检测载药壳聚糖/聚乙烯醇纤维膜在生理盐水中体外释放氨甲环酸、罗哌卡因及纳米银的浓度与时间的关系，通过药物浓度求出特定时间点的累积释放率，计算公式为：药物累积释放率=药物浓度×溶液体积/药物总质量。

1.4.2 出血量评估

术前及术后第1 d抽取兔耳静脉血1 ml，查红细胞比容，血红蛋白，通过体重估计兔血容量［11］，计算总失血量。总失血量计算公式：总失血量（calculated total blood loss,CBL）=（术前红细胞比容-术后红细胞比容）×兔血容量/术前红细胞比容[12]。兔血容量（blood volume,BV）的计算公式为：BV=55.6×体重 （ml）[11]。

1.4.3 兔疼痛评分

通过兔的行为学对兔疼痛程度进行量化评估，观察的主要行为学包括：（1）患肢正常着地；（2）患肢轻着地，伴趾前屈；（3）仅足内侧缘着地；（4）仅足跟着地，后足倒置；（5）整个患肢抬起；（6）舔食患肢。30 min内观察3次，每次300 s，然后按照公式计算疼痛指数T=（t1+2t2+3t3+4t4+5t5）/300 s，其中t1，t2，t3，t4，t5分别代表 5 min 内上对应行为的持续时间［13］。3次评分取平均数。术后第1 d、1周对疼痛进行评分。

1.4.4 感染指标测量

术后1、3 d抽兔耳静脉血检测C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）。术后1、3 d取伤口组织做组织病理切片，计算5个多形核粒细胞（polymorphonuclear granulocytes,PMN）最多的高倍镜视野中的平均值。伤口愈合速度测量：计算创口完全愈合需要的时间，比较两组平均值是否有差异。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。计量数据以±s表示，资料呈正态分布时，两组间比较采用独立样本t检验，组内两时间点比较采用配对T检验；资料呈非正态分布时，采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 载药敷料体外药物释放结果

测得氨甲环酸、罗哌卡因、纳米银的吸收峰波长为466 nm、262 nm、408 nm，通过浓度计算出药物累积释放度，并绘制曲线图，见图1。通过曲线图可以看出累积释放量达到50%时需要大约12 h，而20 h时达到释放平衡。

图1 氨甲环酸、罗哌卡因、纳米银在体外的药物缓释曲线

2.2 出血量评估

通过术前术后1 d抽取静脉血检测红细胞比容，计算出了每只兔的总失血量，新型敷料组的平均失血量显著少于传统敷料组，差异有统计学意义（P＜0.05），资料见表1。

2.3 兔疼痛评分

术后第1 d疼痛指数新型敷料组显著低于传统敷料组，差异有统计学意义（P＜0.05），术后第7 d，两组疼痛指数的差异无统计学意义（P＞0.05）。资料见表1。

2.4 感染指标测量

术后第1 d新型敷料组CRP低于传统敷料组，但两组差异无统计学意义（P＞0.05）。术后第3 d新型敷料组CRP明显低于传统敷料组，差异有统计学意义（P＜0.05），显示新型CRP敷料的抗感染能力强，能更早将兔CRP降至趋于正常。术后第1 d两组PMN差异无统计学意义（P＞0.05），而术后第3 d新型敷料组显著低于传统敷料组，差异有统计学意义（P＜0.05），资料见表 1。

2.5 伤口愈合速度测量

伤口愈合时间新型敷料组少于传统敷料组，差异有统计学意义（P＜0.05）。资料见表1。

表1 两组动物观察及检测结果（±s）与比较

传统敷料组（n=8）2 5.4 3±2.0 2 P值＜0.0 0 1新型敷料组（n=8）1 5.2 0±1.4 3 0.4 7±0.2 1 0.0 5±0.0 3＜0.0 0 1 1.9 6±0.5 7 0.0 6±0.0 3＜0.0 0 1＜0.0 0 1 0.5 4 7 1 4.6 3±3.1 6 8.8 8±3.5 2 0.0 0 4 1 6.7 5±3.1 1 1 3.2 5±2.9 6 0.0 3 7 0.1 9 6 0.0 1 8指标总失血量（m l）疼痛指数1 d 7 d P值C R P（m g/L）1 d 3 d P值P M N（个/高倍视野）1 d 3 d P值伤口愈合时间（d）2 1.6 3±5.3 2 2.8 8±1.2 5＜0.0 0 1 1 2.2 5±0.7 1 2 0.6 3±5.4 8 1 2.8 8±2.1 0 0.0 0 2 1 4.1 3±1.6 4 0.7 1 7＜0.0 0 1 0.0 1 4

3 讨论

壳聚糖作为天然的高分子材料，生物相容性较好，其本身具有止血、抗菌的功效。单用壳聚糖进行电纺丝难以纺出纤维结构，电镜下观察为水滴样结构，因此单用壳聚糖进行电纺丝其力学强度很差。有学者将聚乙烯醇加入壳聚糖按一定的比例混合进行电纺丝，发现可以纺出具有纤维结构的纤维膜［14～16］，而且有学者已经成功将壳聚糖、聚乙烯醇和药物共纺成纤维膜，该膜的力学强度较好，而且可以对药物进行缓释［17］，因此壳聚糖、聚乙烯醇作为药物缓释的载体具有优质的潜能。

良好的局部给药的止血药物要同时具有止血效果可靠、无全身不良反应的特点。骨科临床上经常用的药物为氨甲环酸，有一项荟萃分析显示氨甲环酸局部给药和静脉给药均有明显的止血疗效，且局部给药可能要优于静脉给药［18］。

常用的局部止痛药包括利多卡因、罗哌卡因等。一项研究对比了局部应用罗哌卡因和利多卡因对背部疖痈术后疼痛的止痛效果，结果显示罗哌卡因的止痛效果要优于利多卡因［19］。罗哌卡因局部应用主要利用其麻醉效果，单纯止痛，不会产生其他的副作用，因此是比较可靠的局部伤口的外用止痛药物。

战创伤创口感染的主要常见致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌［20］，因此很难用单一的抗生素同时对抗这三种细菌，如果选择某种或几种特定的抗生素，也会遇到细菌耐药的情况的发生。纳米银具有较强的抗菌效果，而且至今没有发现针对银的细菌耐药性，因此银相关的局部给药复合材料具有广阔的应用前景。多项研究采用银相关药物复合材料对体外抗菌能力以及对局部创口的抗感染性能进行了研究，结果显示其抗菌性能优越。而且局部少量应用银制剂，对全身不会造成毒副作用［21，22］。

目前同类型的伤口敷料一般采用高分子聚合物作为载体，一般载入一种药物。本研究结果显示，新型敷料组的平均失血量显著少于传统敷料组，术后第1天疼痛指数显著低于传统敷料组、伤口愈合时间少于照组，差异有统计学意义（P＜0.05），术后第3 d新型敷料组CRP、PMN明显低于传统敷料组，差异有统计学意义（P＜0.05），结果表明，新型敷料可以显著减少兔开放伤失血量，对创口有明显的止痛作用，抗感染能力更强，能更早地将兔CRP降至趋于正常，更早地将兔创口组织的炎细胞降至趋于正常，能够促进伤口的愈合速度。新型敷料采用壳聚糖/聚乙烯醇作为载体，利用静电纺丝技术，将氨甲环酸、罗哌卡因及纳米银共混编织成纤维结构，具有可靠而稳定的药物缓释性能，集止血、止痛剂抗菌性能于一身，具有便捷性和高效性，符合现在战争战创伤急救的要求。这种复合药物模式还可以进一步改进，可加入其他药物，融合进其他的功能，如表皮生长因子等促进伤口愈合的药物。

结论：载氨甲环酸、罗哌卡因及纳米银的壳聚糖/聚乙烯醇静电纺丝纤维缓释敷料可稳定缓释药物，并对兔战创伤模型具有止血、止痛、抗感染及促进伤口愈合的作用。