Wnt/β-catenin信号通路与膝关节骨性关节炎软骨代谢

丁小芬 周友龙 田明月 贾梦雅 李彦华 杨志孟

(河南中医药大学，河南 郑州 450046)

膝关节骨性关节炎是一种以软骨破坏、软骨下骨改变、骨赘形成及韧带和半月板改变为特征，多见于老年人关节退行性疾病〔1〕，软骨破坏是膝骨性关节炎主要的病理状态〔2〕。膝骨性关节炎被认为是65岁以上人群致残的主要原因，由于肥胖和人口老龄化，其发病率正在上升〔3〕。调查显示，膝关节骨性关节炎60岁以上患病率达50%，在75岁以上人群中患病率高达80%，致残率为53%，发病率的增加带来了严重的医学和社会问题〔4～6〕。Wnt信号通路是调节发育、生长、内稳态和疾病中的关键生物过程，特别是在关节和骨骼中，膝骨性关节炎的发病和严重程度与关节软骨中Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路明显相关〔7〕。本文通过Wnt/β-catenin信号通路探讨膝骨性关节炎发生发展的分子机制、研究软骨代谢对膝骨性关节炎的相关作用，为临床诊疗提供支持。

1 Wnt信号通路

Wnt名字的由来：Wingless最早在果蝇中被发现，是可以导致翅膀组织缺失的基因。Int1基因发现位于小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)整合位点附近，且与Wingless基因具有同源性、功能相似，故将二者名字合并得名为Wnt〔8〕。Wnt信号转导通路分为经典的Wnt/β-catenin信号通路、Wnt/Ca2+信号通路、Wnt/平面细胞极性(PCP)信号通路。近年来，学者发现研究最多的经典Wnt/β-catenin信号通路在膝骨性关节炎的发病过程中起到重要的作用〔9，10〕，与膝骨性关节炎患者软骨细胞的分化、增殖和凋亡有关，此通路的异常会导致膝骨性关节炎的形成。

1.1经典Wnt/β-catenin信号通路的组成 经典信号通路是由细胞外的信号蛋白、细胞膜上的跨膜受体、内源性抑制剂、胞质蛋白、核内转录因子、下游靶基因组成〔11〕。其中信号蛋白是Wnt蛋白家族，该蛋白是一类广泛存在的分泌型糖蛋白，已发现有19个成员，其中Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a和Wnt10a等已被证实参与β-catenin上游基因激活经典通路〔12～15〕；跨膜受体包括低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)5/6、卷曲蛋白(Fzd)；胞质蛋白包括轴蛋白(Axin)、散乱蛋白(Dsh)、腺瘤性结肠息肉病基因(APC)、β-catenin、糖原合成酶激酶(GSK)-3β；核内转录因子有T淋巴因子(TCF)和淋巴增强因子(LEF)；下游靶基因包括基质金属蛋白酶(MMP)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、骨形态发生蛋白(BMP)等。Wnt通路特异性抑制物有分泌性Dickkopf相关蛋白(DKK)-1、分泌型FZ相关蛋白(sFRP)、Wnt抑制因子(WIF)、硬化蛋白(SOST)等〔16〕，Wnt/β-catenin信号通路的各靶点都至关重要，在生理调控方面起关键作用。

1.2经典Wnt/β-catenin信号通路的转导 Wnt信号转导是一种进化上保守的信号转导途径，控制发育的多个方面，包括细胞增殖、细胞命运决定、凋亡、细胞迁移和发育过程中的细胞极〔17〕。当细胞外存在Wnt信号通路特异性抑制物(如DKK-1、SOST、WIF1、sFRP等)时，Wnt蛋白无法与受体Frz和辅助受体LRP5/6结合，APC、GSK-3β、Axin三者形成的降解复合物与细胞质中的β-catenin结合，该降解复合物上的GSK-3β可使β-catenin磷酸化后通过泛素蛋白酶体途径降解，导致细胞质中的β-catenin水平显著降低；当不存在Wnt信号通路抑制物时，Wnt蛋白通过与膜上的跨膜受体Frz和LRP5/6结合，阻碍APC、GSK-3β和Axin三者形成降解复合物，从而抑制β-catenin的磷酸化，导致β-catenin在细胞质内聚集，当达到一定量时，β-catenin向细胞核内转移与TCF/LEF转录复合物结合，该复合物作为转录激活因子可引起经典Wnt信号通路的靶基因表达，从而发挥调控作用〔18〕。在正常机体内，Wnt/β-catenin信号通路的抑制和激活同时存在，维持动态平衡，并与机体生长状态相适应〔19〕。

2 Wnt/β-catenin信号通路与膝骨性关节炎软骨代谢

Wnt/β-catenin信号通路的传导在膝关节骨性关节炎期间调节软骨细胞分化中起着重要作用〔20〕，该通路下游基因和蛋白表达可影响关节软骨生长代谢，与关节软骨损伤相关〔21〕，这一经典途径的激活，已被认为参与膝骨性关节炎的加重〔22〕。

2.1DKK-1 DKK是Wnt/β-catenin信号通路的信号抑制剂，经典的Wnt拮抗家族，可与跨膜受体LRP5/6结合，阻止细胞外Wnt蛋白的配体作用，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路的转导〔23〕。DKK-1是一种分泌性糖蛋白，是Wnt/β-catenin信号通路上游的主要抑制因子之一，可以抑制骨形成〔24〕。Oh等〔23〕观察到无论是通过关节内注射表达DKK-1的腺病毒(AdDKK-1)还是在软骨细胞特异性DKK-1转基因小鼠的背景下，关节软骨中DKK-1的过度表达对包括关节软骨破坏、骨赘形成和软骨下骨硬化在内的膝骨性关节炎发病都具有保护作用，且DKK-1的抑制作用与其抑制Wnt介导的分解代谢因子(如MMP-13)在关节软骨细胞中的表达能力有关。Sassi等〔10〕使用DKK-1处理的去分化人类关节软骨细胞模型，研究结果显示成纤维细胞样形态出现延迟，表明DKK-1能起到抑制膝骨性关节炎发生发展的作用。Funck-Brentano等〔25〕发现DKK-1可能通过介导的Wnt/β-catenin信号通路，抑制β-catenin移位进入细胞核，控制软骨下骨的激活，降低骨赘的破坏生成，导致膝骨性关节炎的严重程度降低。

2.2Wnt3a Wnt蛋白是Wnt/β-catenin信号通路的启动因子。Wnt信号的稳态水平对干细胞增殖、软骨细胞分化和功能至关重要，该信号在膝骨性关节炎关节组织中上调，并驱动骨分化、软骨降解、软骨细胞肥大和炎症〔26〕。在哺乳动物中，鉴定出19种Wnt蛋白，小鼠Wnt3a蛋白是第一个具有生化特性的蛋白〔10〕。Liu等〔27〕发现正常运动诱导膝骨性关节炎和损伤运动诱导膝骨性关节炎大鼠模型中，Wnt3a和β-catenin蛋白水平增加，Ⅱ型胶原减少。Wnt3a是Wnt/β-catenin信号通路典型的、特征良好的激活剂，在关节炎中有既定的作用，并且在关节软骨中表达〔28〕。Thomas等〔29〕研究发现在Wnt3a刺激的软骨细胞中分解代谢蛋白酶(MMP、ADAMTS-4和5)的表达上调，促进细胞外基质(ECM)的降解；Wnt3a会诱导MMP13基因在小鼠原代软骨细胞中快速表达，导致骨关节炎样表型〔30〕；Lietman等〔31〕也发现Wnt3a略微增加了人软骨细胞中MMP-13的表达。Bouaziz等〔32〕发现Wnt3a可通过增强β-catenin到细胞核中的易位来增加Wnt/β-catenin的转录活性，增强分解代谢物(ADAMTS-4和5、MMP3、MMP-13)的表达。

2.3β-catenin β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的核心元件〔33〕，在软骨细胞的分化、成熟、凋亡中发挥重要作用，细胞中β-catenin表达多少决定着经典Wnt信号通路是否被激活〔34〕。Zhu等〔35〕发现成年小鼠关节软骨细胞中β-catenin的激活导致MMPs的明显增加，引起ECM降解，软骨细胞过早分化并发展成膝骨性关节炎样表型。Zhou等〔36〕发现条件性激活β-catenin信号的转基因小鼠表现出严重的软骨变性、软骨下骨侵蚀和骨赘形成。Held等〔37〕通过对β-catenin进行染色，测试该蛋白是否作为典型Wnt信号转导的突出效应器，实验观察到随着膝骨性关节炎分级的增加，β-catenin染色增加，这证实了人膝骨性关节炎软骨中典型Wnt信号的激活。Bouaziz等〔38〕发现阻断β-catenin/TCF的相互作用，能够减轻小鼠的膝骨性关节炎表型并下调MMP-13的表达。研究表明〔39，40〕，β-catenin缺失的软骨细胞降低了骨保护素的表达或增加了核因子(NF)-κB配体的受体激活因子的活性，导致破骨细胞形成增加，小梁骨形成和重塑减少。

2.4MMP-13 MMPs是一种蛋白水解酶，是Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因。在人类MMP家族中至少有26种类型的分子，与正常软骨相比，MMP-1、MMP-3、MMP-13和MMP-28在膝骨性关节炎软骨中的表达明显增强，特别是MMP-13在软骨破坏中发挥中心作用〔2〕。MMP-13是在对乳腺癌组织研究时被发现与鉴定出来的，其在正常组织中不表达，而在膝骨性关节炎软骨细胞中有高表达〔41〕。MMPs主要参与膝骨性关节炎中ECM的分解，其表达增加与膝骨性关节炎的进展密切相关，在这些MMPs中，MMP-13通过降解ECM被认为在膝骨性关节炎的进展中发挥关键作用，例如Ⅱ型胶原的降解，这是ECM的主要组成成分〔42〕。Yuasa等〔43〕发现Wnt3a激活Wnt/β-catenin途径后，兔关节软骨中的MMP-3和MMP-13的基因表达增加。先前的一项研究还发现，转基因小鼠中MMP-13的高表达水平可导致膝骨性关节炎样病理改变的出现〔44〕，Wnt/β-catenin信号通路在这一过程中起重要作用，β-catenin的过度表达可导致MMP-13基因表达增加，从而导致软骨基质降解〔27〕。因此，抑制MMP-13的表达可能给予软骨保护，这在膝骨性关节炎的治疗中具有治疗价值〔45〕。

3 中西医调控Wnt/β-catenin信号通路与膝骨性关节炎软骨代谢

Wnt/β-catenin信号通路的转导是调节膝骨性骨关节炎发展的独特信号通路，参与了膝关节骨性关节炎的发病机制〔46〕。越来越多的研究者通过大量的实验，用不同的干预方法证实了Wnt/β-catenin通路与膝骨性关节炎有着特殊的联系。

3.1中医疗法 颜春鲁等〔47〕研究发现大剂量右归丸干预后，能够有效促进膝骨性关节炎模型组大鼠DKK-1mRNA和蛋白的表达，抑制WISP1、Wnt1、β-catenin和LRP5 mRNA和蛋白质表达，进而推测右归丸可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路起到治疗膝骨性关节炎的目的。还发现富硒黄芪皂苷的治疗机制可能是通过升高DKK-1基因和蛋白的表达，降低WISP1、β-catenin、LRP5基因和蛋白的表达，实现对膝骨性关节炎的治疗作用〔48〕。何晓娟等〔49〕研究结果显示跳骨片治疗膝关节骨性关节炎可能通过上调GSK-3β的表达、下调β-catenin、Frizzled-2的表达，调控Wnt/β-catenin信号通路，达到保护关节软骨的作用。Zhong等〔50〕发现青蒿素通过抑制白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α和MMP-13等促炎趋化因子和细胞因子的表达，在IL-1β诱导的大鼠OA软骨细胞和OA患者来源的细胞中显示出强大的抗炎作用。邝高艳等〔51〕研究发现加味独活寄生合剂治疗膝骨性关节炎的作用机制可能与调控Wnt信号通路有关，通过抑制炎症反应，从而减轻疼痛，改善膝骨关节功能。马勇等〔52〕研究初步证明了姜黄素对软骨细胞的保护作用是通过调控Wnt/β-catenin信号通路，从而促进正常软骨细胞增殖，中药姜黄具有抗骨关节炎作用，是因为姜黄素是有效成分之一。张媛媛等〔53〕通过电针“内膝眼”“犊鼻”可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的转导，降低下游靶基因MMP-13的表达，从而抑制软骨基质的降解和软骨细胞的凋亡，起到延缓膝骨性关节炎发展进程的作用。周伟等〔54〕在对活血膏作用于膝骨性关节炎作用机制探讨中发现膝骨性关节炎发病后的确存在Wnt/β-catenin信号通路被激活，抑制该通路过表达是治疗膝骨性关节炎的关键，发现活血膏可明显抑制这一过程。

3.2西医疗法 Yu等〔55〕发现辛伐他汀可以缓解膝骨性关节炎相关的疼痛，抑制OA患者的Wnt/β-catenin信号转导，该信号通路途径的调节在辛伐他汀诱导的软骨细胞分化的调节中起重要作用。Xu等〔56〕通过研究首次证明聚半乳酸通过抑制Wnt/β-catenin和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路抑制大鼠软骨细胞MMPs的表达和软骨细胞的炎症反应，表明聚半乳酸可以作为OA的治疗剂。姜鹏等〔57〕研究发现关节腔注射臭氧后膝关节软骨β-catenin和MMP-13表达降低，臭氧可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活治疗膝关节骨性关节炎。吴小川〔58〕探讨阿仑膦酸钠治疗膝骨性关节炎作用机制发现Wnt/β-catenin可与骨保护素(OPG)/NF-κB受体活化因子(RANK)/RANK配体(RANKL)等信号通路共同作用于软骨细胞软骨下骨，并影响下游MMP-13、β-catenin及Ⅱ型胶原蛋白的表达，起到治疗膝骨性关节炎的作用。

综上，近年来，学者们主要着眼于细胞因子水平的研究，调控内环境稳态的众多信号通路成为研究的热点，炎症介质、生长因子和不同的信号通路可能同时参与了这个过程并相互影响，如Wnt、NF-κB、MAPK、OPG/RANK/RANKL、Notch等信号通路〔59，60〕与膝骨性关节炎的发病关系均可查到相关文献，为进一步阐明膝骨性关节炎的发病机制奠定了基础。开发选择性地针对该途径的关键调控因子，作为治疗膝骨性关节炎等许多骨疾病的新治疗方式的基础疗法似乎具有很大潜力，并且在这方面的动物实验已经取得了一些进展。虽然动物实验对于阐明Wnt信号转导调节软骨生物学和病理学的细胞和分子机制至关重要，但人类生物学方面的多样性和复杂性远远高于其他生物，人类是高级生物，因此，我们不应该高估动物实验的结果，应该谨慎地将这些发现应用于人类。我们已经了解到该途径在骨生物学的许多方面发挥的核心作用，但还需要更细致的了解Wnt/β-catenin信号通路在生理和病理环境下是如何运作的，才能寻找出该通路上最有效增强剂或抑制剂来治疗膝骨性关节炎。