口腔颌面部恶性肿瘤外周血循环肿瘤细胞检测及其临床意义

张帅源， 付昊杰， 秦 硕， 李光辉， 易雅群， 孙明磊

（郑州大学第一附属医院口腔颌面外科，河南 郑州 450052）

在全球范围内，口腔颌面部恶性肿瘤每年新发病例超过60 万，约占所有癌症的10%，是临床上最为常见的恶性肿瘤之一[1-2]，其好发于舌、颊、牙龈、颌骨、唾液腺等重要解剖部位，严重危害人类的健康[3]。 饮酒、吸烟、咀嚼槟榔、长期物理化学因素刺激以及人乳头状瘤病毒（human papilloma virus, HPV）感染等是口腔颌面部恶性肿瘤最主要的发病因素[4-6]。 治疗方面，根据口腔颌面部恶性肿瘤患者的临床分期，可选择不同的治疗方案，如手术切除、放疗、化疗、及综合序列治疗等。 早期肿瘤（Ⅰ期或Ⅱ期）患者可采用单纯手术治疗或放疗，并有较大的治愈可能，但临床多数患者确诊时已为晚期（Ⅲ期和Ⅳ期）， 其中部分患者已错失手术时机，只能采用放化疗等姑息疗法，预后较差[3,7]。 因此，早期发现肿瘤并及时有效地治疗， 对提高口腔颌面部肿瘤患者的生存率及生活质量至关重要。 目前临床上迫切需要一种便捷、高效的检查手段，用于恶性肿瘤的早期诊断和筛查， 这对于改善癌症患者的预后有着重要的临床意义。 目前，临床上一般依靠切取活检， 局部穿刺等组织病理学检查来诊断，创伤较大且效率较低。 近年来CTCs 等“液体活检”[8]技术的出现，使得通过外周血检测肿瘤标志物来获取更为全面有效的肿瘤临床病理相关信息成为可能[9]。

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）是从原发肿瘤脱落到邻近血管，随后出现在恶性肿瘤患者血液循环中的癌细胞[10]。 有文献报道，CTCs 的数量和分子特征与肿瘤负荷、癌症进展、对抗治疗的反应及患者生存率显著相关[11]。 由于CTCs 在血样中非常罕见（1×109个正常血细胞中仅有1~10 个CTCs）且半衰期较短等因素，传统方法难以准确检测[12]。随着检验技术的发展，最新的阴性富集及靶向PCR 检测技术成功地解决了上述问题。 该方法基于CTCs 与正常血细胞表面抗原CD45＋之间的表达差异， 利用免疫磁珠将两者分离并最大限度地将CTCs 纯化，大幅提高了检测质量[13-14]。 叶酸受体（folate receptor，FR）是一组跨膜蛋白，分为 α、β 和 γ 3 种亚型， 由于FR 在人体大多数的肿瘤细胞中均有特异性的高表达，如卵巢癌、肺癌、头颈部癌等，而在正常组织中极少表达， 是一种理想的CTCs 检测靶点。最新研究表明，CTCs 在结直肠癌[15]、肺癌[16]、泌尿系恶性肿瘤等[17]癌症的临床诊治中有着重要的指导意义， 但目前CTCs 在口腔颌面部恶性肿瘤的相关研究较少见。本研究以肿瘤表面FR 为靶点，应用阴性富集及靶向PCR（FR+CTC）检测技术，检测口腔颌面部恶性肿瘤患者外周血的CTCs 值， 分析其与病理分期、分化程度、临床分期、淋巴结转移等临床病理指标的关系， 探讨CTCs 检测的临床价值和应用前景。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择2019 年5 月—2020 年5 月间郑州大学第一附属医院确诊的119 例口腔颌面部恶性肿瘤患者为实验组，同期选取20 例健康志愿者为对照组。实验组中，男性 78 例（65.5%），女性 41 例（34.5%），年龄 16~89 岁，平均年龄（52.71±13.44）岁；病理类型包括：鳞状细胞癌93 例，黏液表皮样癌11 例，腺样囊性癌6 例，唾液腺导管癌6 例，肌上皮癌3 例。对照组中，男性 9 例（45%），女性 11 例（55%），年龄22~69 岁，平均年龄（44.60±12.66）岁。 本研究纳入标准：①病理诊断为口腔颌面部恶性肿瘤；②无其他部位原发恶性肿瘤；③入院前未接受放疗、化疗及手术等其他相关治疗。 排除标准：①入院前曾接受放疗、化疗及手术等其他相关治疗； ②严重感染或肝肾功能严重异常；③生活不能自理或不能配合治疗者。

1.2 CTCs 的富集与检测

CTCs 的检测采用负向富集及靶向PCR 检测技术。 严格遵循采血标准，取患者3 mL 静脉血，血样中加入红细胞裂解液孵育， 红细胞裂解后离心，加入CD45+磁珠结合白细胞， 用磁场捕获并去除白细胞，剩余富含CTCs 的细胞群，加入特异性探针（针对表达叶酸受体α 的细胞设计，由靶向叶酸受体的叶酸单元与共价偶联的寡核苷酸单元组成） 标记CTCs，离心，去除上清液，游离探针，加入洗脱剂，洗脱与CTCs 特异性结合的探针，制备待测样品，加入PCR 扩增试剂后进行荧光实时PCR 扩增 （PCR 扩增模板的寡核苷酸单元序列为：5′-CTCAA CTGGT GTCGTT GGGCA ATTCA GTTGA TT CTAA-3′），经数据分析，计算出3 mL 血样中的CTCs 值。

1.3 统计学方法

采用R 4.0.0 统计软件（R Foundation for Statistical Computing，奥地利）进行数据分析。单组间比较采用Kruskal-Wallis 检验， 多组间比较采用Mann-Whitney U 检验。 应用受试者工作曲线（receiver operating characteristic curve，ROC） 分 析 外 周 血CTCs 对口腔鳞状细胞癌 （oral squamous cell carcinoma，OSCC）及淋巴结转移的诊断价值，并通过其灵敏度和特异度来计算约登指数。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血CTCs 值的比较

实验组CTCs 值较对照组明显升高， 差异有统计学意义（P＜0.001）。 见表 1。

表1 实验组与对照组CTCs 值的比较Table 1 Comparison of CTCs values between experimental group and control group

2.2 外周血CTCs 与口腔颌面部恶性肿瘤临床病理特征的关系

实验组CTCs 值与患者的性别、年龄、原发灶部位等无关（P＞0.05）。与恶性肿瘤的周围组织浸润、淋巴结转移等相关，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与肿瘤负荷、肿瘤T 分期和N 分期呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.05）。 M1 期患者的 CTCs 值较 M0期显著增高，Ⅲ、Ⅳ期患者的CTCs 值高于Ⅰ、Ⅱ期者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 见表 2。

表2 外周血CTCs 与OSCC 临床病理特征的关系Table 2 The relationship between CTCs and clinicopathological characteristics of OSCC

2.3 外周血CTCs 对口腔颌面部恶性肿瘤的诊断价值

CTCs 诊断恶性肿瘤的曲线下面积 （area under curve，AUC）值为 0.932（表 3），检验能效性有统计学意义（P＜0.001，95%CI 为 0.916~0.950），当血 CTCs值是8.45 FU/3 mL 时，约登指数最大为0.866，诊断口腔颌面部恶性肿瘤的灵敏度为91.6%， 特异度95.0%。 见图 1。

图1 CTCs 检测诊断口腔颌面部恶性肿瘤的ROC 曲线Figure 1 The ROC curve of CTCs in diagnosis of oral and maxillofacial malignancies

表3 CTCs 用于颌面部恶性肿瘤诊断的ROC 曲线分析结果Table 3 The ROC analysis of CTCs in diagnosis of maxillofacial malignant tumors

2.4 外周血CTCs 检测对口腔颌面部恶性肿瘤淋巴结转移的诊断价值

CTCs 诊断肿瘤淋巴结转移的AUC 值为0.693，检验能效性有统计学意义 （P=0.003，95%CI 为0.690~0.744），当 CTCs 值为 12.25 FU/3 mL 时，约登指数最大为0.434，敏感度69.0%，特异性74.4%。 见表 4、图 2。

表4 CTCs 用于诊断肿瘤淋巴结转移的ROC 曲线分析结果Table 4 The ROC analysis of CTCs in diagnosis of tumor lymph node metastasis

图2 CTCs 检测诊断口腔颌面部恶性肿瘤转移的ROC 曲线Figure 2 The ROC curve of CTCs in diagnosis of oral and maxillofacial malignancies metastasis

3 讨论

目前CTCs 与肿瘤的临床相关性研究较多，虽然各研究之间存在一定差异，但总体而言，CTCs 与肿瘤发生、发展之间存在着千丝万缕的联系。 Chen等[18]的研究表明，非小细胞肺癌患者较健康人CTCs值升高（P＜0.001）。 Ding 等[19]的研究显示，在肺腺癌中Ⅲ、Ⅳ期患者的CTCs 值较Ⅰ、Ⅱ期高（P=0.000），肿瘤体积大的患者比肿瘤体积小的患者CTCs 高（P=0.001）。 Lou 等[20]的研究发现，在非小细胞肺癌中， 发生转移患者较未转移者的 CTCs 高 （P=0.045）。

本研究应用当前最新的阴性富集及靶向PCR检测技术，有较高的参考价值。 检测结果显示，实验组较对照组CTCs 值明显升高，表明CTCs 的升高与恶性肿瘤的发生关系密切，与Chen 等[18]的研究结果一致。 通过绘制受试者工作曲线（ROC 曲线），计算出外周血CTCs 诊断口腔颌面部恶性肿瘤的AUC值为0.932， 通过其灵敏度及特异度计算出约登指数为 0.866， 该数值对应的外周血 CTCs 值为8.45 FU/3 mL，此时灵敏度与特异度均＞90%，有较高的检验效能， 用于临床可有效区分出恶性肿瘤。当CTCs 值＜8.45 FU/3 mL 时患癌可能性较小，若高于此值，则需密切随访并行必要的检查排查肿瘤的可能。 本研究发现， 口腔颌面部恶性肿瘤患者的CTCs 水平与肿瘤负荷、T 分期及N 分期呈正相关，有肿瘤周围组织浸润者较无浸润者CTCs 水平明显升高， 淋巴结转移者较无淋巴结转移者CTCs 水平高，表明CTCs 水平与肿瘤负荷、临床分期、肿瘤周围组织浸润，淋巴结转移等密切相关。 另外，远处转移者较无远处转移者的CTCs 水平高， 与Lou 等[20]的研究结果相一致。 口腔颌面恶性肿瘤较易发生淋巴结转移， 远处转移相对少见， 本研究着重评估CTCs 对肿瘤淋巴结转移的诊断价值。 运用淋巴结转移组和未转移组的数据绘制ROC 曲线， 计算出AUC 值为0.693，约登指数为0.434，相对应的CTCs值为12.25 FU/3 mL， 灵敏度为69.0%， 特异度为74.4%。 临床应用中，当患者 CTCs 值＞12.25 FU/3 mL时有较大的淋巴结转移可能。 另外在CTCs 与患者临床分期相关性研究中也发现，Ⅲ、Ⅳ期患者相较于Ⅰ、Ⅱ期患者CTCs 水平明显升高，这与Ding 等[19]的研究结果一致。 以上结果表明，CTCs 在口腔颌面部恶性肿瘤的辅助诊断、 评估肿瘤的负荷大小、临床分期、有无周围组织浸润、有无转移倾向，以及量化反映肿瘤的活跃程度和疾病的进展状况等方面都有重要的临床意义。

本研究也存在一定的不足， 由于随访时间较短，未能进行完整的疗效相关性分析，后续作者将延长随访时间，进一步探讨CTCs 对口腔颌面部恶性肿瘤疗效评估的价值。 另外对照组纳入的人数较少，后续可扩大样本量，以精确CTCs 在健康人中的趋近值。