一种基于近红外的半夏炮制品快速鉴别方法

黄露，周勤梅，熊亮，彭成，耿昭，郭力▲，曹小玉▲

(1.成都中医药大学，四川 成都 611137；2.四川省食品药品检验检测院，四川 成都 611371)

半夏药材为天南星科植物半夏Pinelliaterneta(Thunb.)Breit.的干燥块茎，收载于《中国药典》2015版，性温味辛，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结等功效[1]。其主要化学成分包括生物碱、凝集素、脂肪酸、氨基酸等，主要用于治疗咳嗽痰多、胸闷胀满、恶心呕吐等。现代研究表明半夏具有镇咳、祛痰、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性[2]，同时半夏也是常见的有毒中药，在《神农本草经》中被列为下品，因其味辛辣、麻舌而刺喉，内服需炮制后使用。目前，对于半夏的毒性物质存在较大争议，草酸钙针晶和凝集素蛋白被认为是对黏膜具有强烈的刺激作用及导致炎症反应的主要成分[3-5]。

半夏药材在临床中应用广泛，市场上已有的中成药种类繁多，如半夏糖浆、藿香正气水、金不换膏、伤风止痛膏等。目前，《中国药典》中收载的炮制品主要有三种，分别为法半夏、姜半夏、清半夏。传统上，主要是通过形态鉴别、性状鉴别、理化鉴别等方法，初步对半夏与其炮制品和伪品进行区别[6]。随着分析技术的快速发展，紫外光谱法[7]、近红外光谱法[8]、高效液相色谱法[9]、电子鼻技术[10]、DNA分子鉴定技术[11]等已逐步应用于半夏与伪品的鉴别，为药材的质量保障发挥了积极的作用。而目前对于半夏不同炮制品的鉴别研究报道较少。研究者们对半夏及其炮制品的核苷类成分[9]、浸出物含量[12]、草酸钙针晶[13]、蛋白质[14]以及指纹图谱[15]进行分析，还采用红外光谱技术对其进行表征[7]，为半夏不同炮制品质量控制和提高奠定了基础。

近红外光谱法(NIR)通过对样品进行快速测定，在短短几分钟内可以得到数十个样本的数据。这种样品用量少,无损,可以高效、快速地得到大样本量的分析技术，近年来已被广泛用于中药材产地鉴别、真伪鉴别、炮制机理研究等领域[16-19]。本研究采用NIR法对半夏不同炮制品进行研究，应用二阶导数谱图、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和K近邻分类算法(KNN)对法半夏、姜半夏、清半夏进行分析比较，旨在建立一种半夏炮制品快速鉴别的方法，为半夏药材的炮制工艺和质量评价提供参考依据。

1 实验材料

1.1 实验药物

135批半夏炮制品样品来源于中国30个省份的多家生产企业、医疗机构、批发和零售单位，其中姜半夏46批，清半夏30批，法半夏59批。所有样品均由成都中医药大学药学院高继海副教授鉴定为半夏炮制品。

1.2 实验仪器

傅里叶变换近红外光谱仪(美国珀金埃尔默公司，型号：Spectrum Two N)；石英玻璃样品池(美国珀金埃尔默公司，直径3.0 cm,高1 cm)；旋转器漫反射积分球(美国珀金埃尔默公司)，高速中药粉碎机(浙江永康市溪岸五金药具厂，型号：HX-200)；OMNIC Spectra 8.2分析软件(ChemPattern 2017版，科迈恩科技有限公司)。

2 实验方法和结果

2.1 图谱采集

将饮片粉碎，过65目筛，取3 g左右样品粉末装入石英样品杯中，平铺均匀平整，采用积分球漫反射方法按以下条件进行图谱采集：分辨率8 cm-1，光谱扫描范围4 000～10 000 cm-1，扫描64次。每个样品重复装样并扫描4次，应用OMNIC Spectra 8.2软件求取平均光谱。135批样品原始NIRS光谱叠加图见1，图中半夏三种炮制品的原始NIRS光谱差异性很小，整体化学成分的表征未出现明显差异，很难对半夏炮制品进行分类。

图1 半夏炮制品的NIR原始图谱

2.2 图谱分析

采用OMNIC Spectra 8.2软件对上述光谱进行13点SG平滑、基线校正Noise去噪等预处理。为了更好地比较分析，再求取法半夏(FBX)、姜半夏(JBX)、清半夏(QBX)各自的平均光谱图。见图2，三组平均光谱在峰型和吸收度上相似度较大，且变化趋势基本一致。在8 336.91、6 861.57、6 311.60、5 861.42、5 668.34、5 162.24、4 772.29、4 330.16 cm-1附近均处较强的吸收峰，可以得出半夏在经过不同方法炮制后的主要化学成分基本不变，这8处较强的吸收峰可作为法半夏、姜半夏、清半夏共有的特征峰。对三种炮制品的平均光谱进行光谱的结构解析[20]：8 336.91 cm-1主要是OH的一级倍频吸收带；6 861.57 cm-1主要是CONH2、OH的一级倍频吸收带；6 311.60 cm-1主要是CH的一级倍频吸收带；5 861.42 cm-1、5 668.34 cm-1主要是CH2、CH、SH的合频吸收带；5 162.24 cm-1主要是CONH2、OH的合频吸收带；4 772.29 cm-1主要是NH的合频吸收带；4 330.16 cm-1主要是CH、CN的合频吸收带。

图2 法半夏、姜半夏、清半夏的平均光谱

应用OMNIC Spectra 8.2软件对法半夏、姜半夏、清半夏的平均光谱求取二阶导数光谱。通过二阶导数光谱可以更好地分辨一维近红外光谱中的重叠吸收峰，增强谱图的特征性，提高分辨率，快速的确定谱图的峰型、位置及数目，实现快速、准确的鉴别不同炮制品药材。如图3所示，3种不同炮制品半夏的二阶导数光谱图的主要差异集中在7 400～7 100 cm-1范围内。在此范围内，7 348.42 cm-1和7 120.91 cm-1处法半夏和姜半夏有共有峰a和c，除此之外，法半夏在7 281.41 cm-1处有特征峰b。二阶导数光谱中法半夏、姜半夏、清半夏在峰数、峰型和吸收强度上大致相同，见图4。

图3 半夏炮制品二阶导数光谱比较

图4 半夏炮制品7 400～7 100 cm-1范围内二阶导数光谱比较

2.3 多元统计分析

2.3.1 聚类分析

将光谱数据导入ChemPattern软件，校正光谱。设置编号为1的法半夏为代表性样品，光谱数据采用多元散射矫正(MSC)进行预处理，采用欧式距离计算所有样品相似度，如图5所示。结果显示，法半夏相似度较高，而姜半夏与清半夏较难区分。为了直观分析相似度和炮制方法在不同半夏炮制品的影响，采用近邻连接法，欧氏距离为度量标准区间，进行聚类分析。结果见图6。54批法半夏聚为一类，21批清半夏聚为一类，剩余清半夏与姜半夏聚为一类。

图5 半夏炮制品相似度分析

图6 半夏炮制品的聚类分析树状图

2.3.2 偏最小二乘法判别分析

将样本按照5∶1选取训练集和测试集，其中法半夏43份、姜半夏37份和清半夏24份作为训练集数据，每组剩余样本则作为测试集数据，光谱数据采用多元散射矫正(MSC)进行预处理。采用PLS-DA建立半夏不同炮制品识别模型，以模型识别率为指标，通过留一交叉验证确定潜变量数，结果见图7。当潜变量数为8时，模型的识别率最高为99%，因此选择8个潜变量建立PLS-DA模型。预测结果见图8。结果表明所选的PLS-DA半夏炮制品识别模型准确可靠，可用于快速区别半夏炮制品。

2.3.3 K最近邻分类算法

采用ChemPattern KNN分类法对三种半夏不同炮制品进行快速鉴别。将所有样本分为训练集(4/5)和测试集(1/5)，光谱数据采用多元散射矫正(MSC)进行预处理，通过留一交叉验证法选择最近邻法参数K，结果如图9所示。当K=3时，识别率最佳；随着K值增大，识别率有所降低。因K值越大模型越不容易过拟合[18]，因此K值确定为2。采用KNN法对不同炮制品半夏建模，结果如图10所示。不同炮制品之间可以明显地识别，KNN模型对训练集样本的识别率为98%，对测试集样本识别率均为100%。说明建立的KNN模型分类效果较好，能够准确鉴别半夏炮制品。

图7 PLS-DA模型潜变量数与识别率关系图

图8 半夏炮制品的PLS-DA预测效果图

图9 最近邻法参数K与KNN模型识别率关系图

图10 半夏炮制品的KNN模型识别效果图

3 讨论

“五月半夏生，盖当夏之半”，效如其名，半夏有“一两降逆止呕，二两安神催眠”之说，因其药效猛烈，常炮制后使用[21]。姜半夏、法半夏、清半夏是其常用的三种炮制品。目前，半夏的含量测定主要以琥珀酸为对照，而琥珀酸无共轭结构，在紫外范围吸收低且在半夏中含量低，难以检测，所以通过单一的成分或某一类成分对半夏进行质量控制仍然存在一定的局限性。相比高效液相色谱法、气相色谱法、红外光谱法、紫外光谱法等，近红外光谱分析方法在分析鉴别方面具有明显的优势。近红外光谱分析技术通过对粉末进行近红外光谱的测量，并进行光谱校正及光谱数据预处理，采用适合的化学计量方法建立校正模型，通过测试集样品数据进行比较，可快速地实现样品的定性、定量分析[17]。与传统中药材鉴别方法相比，该方法在大批量样本鉴别时能够快速准确地得到分析结果，同时具有无损耗、无污染、易操作、易普遍等优点。

半夏不同于其他药材，经不同的方法炮制后，整体化学成分的表征未出现明显差异。对三种半夏炮制品的135批样本分析，结果显示近红外光谱中，半夏炮制品在8 336.91、6 861.57、6 311.60、5 861.42、5 668.34、5 162.24、4 772.29、4 330.16 cm-1处均有较强的振动吸收，表明半夏不同炮制品的主要化学组分较为相似。在平均光谱中，5 162.24 cm-1处主要是水OH伸缩振动的一级倍频吸收带、6 861.57 cm-1处是其合频吸收带[22]，半夏炮制品在此波段未出现明显差异。3种半夏炮制品的二阶导数光谱图的主要差异集中在7 400～7 100 cm-1范围内，该区间主要是OH的一级倍频吸收带。半夏药材中含OH官能团的主要成分为多糖类成分(淀粉含量高达70%以上)，其含量顺序大致为法半夏>清半夏>姜半夏，与文献报道一致[23]。

根据样本相似度及聚类分析结果显示，法半夏与姜半夏、清半夏的相似度具有明显分界线，其中姜半夏和清半夏的相似度无显著差异，推测可能与姜半夏和清半夏炮制方法比较接近有关，二者在炮制过程中均使用了白矾，从而对半夏中的化学成分影响较为相似。进一步将样本按5∶1选取训练集和测试集，采用留一交叉验证法对半夏炮制品进行模式识别，建立PLS-DA模型及KNN分类模型，利用测试集评价所建立模型的识别效果，结果发现模型的识别率均为100%，表明PLS-DA模型与KNN模型对半夏炮制品可以进行准确的识别。经多元统计分析，二阶导数光谱结合聚类分析、PLS-DA和KNN模型，得出法半夏、姜半夏、清半夏具有明显的对应性。从不同模型的分类效果可知，采用留一交叉验证法建立的PLS-DA模型效果最佳。本文采用NIR光谱技术，以半夏炮制品为研究对象，建立了近红外光谱的化学计量分析模型，经实验验证模型的预测性能较好，可快速区别半夏炮制品，为半夏药材的炮制工艺和质量评价提供科学的参考依据。