钛植入物促骨整合及抗感染涂层的研究进展

陆肖璇 张露露 阳 曦 陈佳龙

(安徽医科大学口腔医学院/附属口腔医院，口腔疾病研究安徽省重点实验室，合肥 230032)

引言

人口老龄化加剧导致骨科疾病发病率增加，并带动了骨科植入物使用量的快速增长。钛及其合金因其稳定的化学性质和良好的人体亲和性成为最常用的骨科植入材料[1]，但其性能并不理想，导致植入失败屡屡发生，其中植入物的无菌性松动和感染是导致失败的主要原因。据统计，在早期和晚期膝关节翻修中，感染因素占所有病因的比率分别为38%和22%，无菌性松动占比分别为23%和51.4%[2]。因此，解决无菌性松动和感染是提高骨科植入成功率的关键。本文综述了钛基骨科植入物无菌性松动和感染问题的最新解决方案，尤其是同时解决这两个问题的最新进展(见图1)。

图1 钛植入物促成骨和抗菌涂层类型及效果。(a)无菌性松动的解决策略；(b)植入物感染的解决策略；(c)同时解决无菌性松动和植入物感染的策略Fig.1 The types and effects of osteogenic and antibacterial coatings of titanium implants.(a) Strategies for aseptic loosening；(b) Strategies for implant infections；(c) Strategies for solving both aseptic loosening and implant infections

1 无菌性松动的研究现状

无菌性松动发生率与植入物表面骨整合速度呈负相关。除了与医生的操作技术密切相关外，骨整合效果还与愈合过程中植入物与周围骨组织的相对微动和产生的磨损颗粒大小数量、植入物周围骨长入和骨组织重塑等因素有关。

1.1 植入物－骨界面间隙的改善

植入物－骨界面处微小间隙是无菌性松动发生的重要原因之一[3]。在重力和压力作用下，微小间隙会引起植入物的微动并导致间隙逐渐变大；另外，植入物－骨界面处微动摩擦所产生的磨损颗粒堆积在界面处，会阻碍植入物与骨直接接触[3]，伴随而来的局部炎症反应和联级反应导致破骨细胞富集、骨吸收、间隙进一步增大，最终发生植入物松动、细菌侵入甚至植入失败[4]。

解决种植体-骨界面间隙的可行方法主要是使用具有高弹性、自膨胀能力的涂层，通过植入后涂层自膨胀或变形填补界面间隙，减少植入物的微动及磨损。Fournier 等[5]将具有高压缩强度、形状记忆和超弹性的镍钛合金丝编织成多孔弹性结构并焊接到植入物表面，当其植入体内后，可以在股骨腔内向外膨胀以填充植入物－骨组织的间隙，减少微动。结果显示相比无修饰组，弹性结构修饰显著促进了骨长入，加速骨整合。Garner 等[6]利用可降解的聚乳酸－羟基乙酸和不可降解的聚乙二醇，制备了一种溶胀性能可控的水凝胶并将其运用于组织扩张器，结果显示，该材料具有良好的生物相容性和可控的溶胀性能，提示修饰骨科钛植入物表面有可能解决间隙导致的问题。

1.2 促骨整合的植入物表面修饰

在骨整合的过程中，植入部位周围细胞分泌各种细胞因子以促进成骨细胞募集和诱导成骨分化，实现骨形成。骨形成速度决定种植体周围骨长入、周围骨组织重塑的进程，也影响界面间隙封闭速度。由于钛基植入材料缺乏良好的生物活性导致成骨细胞在其表面黏附差，甚至发生异物反应[7]，造成局部骨质量差、愈合缓慢等问题。提升植入物表面生物活性以促进骨整合是解决这些问题的主要策略(见图1(a))。

1.2.1 表面形貌构建

植入物表面形貌可以影响骨整合。常见的表面形貌改善方法包括喷砂、酸蚀刻、阳极氧化等。Bang 等[8]采用酸蚀法制备了粗糙的钛表面，并通过水热处理沉积了碳酸钙(CaCO3)涂层，结果显示，CaCO3涂层增加了表面粗糙度，与光滑钛表面相比，被酸蚀的粗糙钛表面含有更多Ca2＋，可快速诱导界面的骨整合和矿化。微弧氧化(microarc oxidation，MAO)可在钛表面形成紧密结合的多孔结构以促进成骨细胞的黏附和增殖，Zhao 等[9]使用MAO 在钛表面制备了锰－二氧化钛微孔涂层，该涂层显示出良好的生物相容性，不但可促进成骨细胞的黏附、增殖与分化，且涂层中Mn2＋的释放可促进表面矿化。

1.2.2 磷酸钙涂层修饰

传统的磷酸钙涂层具有良好的骨传导性，被广泛运用于骨组织工程[10]。Ke 等[11]采用激光近净成形(laser engineered net shaping，LENSTM)和等离子喷涂沉积技术在钛表面制备了梯度羟基磷灰石涂层，梯度涂层解决了传统离子喷涂法界面结合强度弱的问题，并提高了表面骨传导性。Yao 等[12]使用电化学阳极氧化法在Ti 和Ti-6Al-4 V 表面生长纳米管并沉积磷酸钙，显示纳米管结构促细胞黏附能力更强，磷酸钙涂层促进成骨细胞的增殖和分化，并有效阻止金属离子向外扩散，提高生物相容性。

1.2.3 生物分子涂层修饰

细胞外基质蛋白、生长因子、趋化因子等在促骨整合方面的性能已经被证实，将部分蛋白或因子整合在骨科假体表面可以有效改善生物相容性、促进骨整合。Bai 等[13]利用水凝胶包裹了骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)等生物活性物质，并与多孔钛合金支架共同构建了一种三维无机-有机超分子生物活性植入物，通过持续释放BMP－2 诱导BMSCs 的成骨分化。随着水凝胶的降解，骨组织会长入支架孔隙中，实现良好的骨整合。Chen 等[14]在钛表面通过层层组装技术装载了骨化三醇(calcitriol，维生素D3 的重要代谢产物)和肽激素降钙素(calcitonin，CT)，形成具有多层膜结构的分子储存库，持续释放的骨化三醇和CT 分别促进了种植体周围成骨细胞的钙结合蛋白和BMP-2 表达上调，加速骨整合。Ma 等[15]采用阳极氧化法制备了二氧化钛(TiO2)簇状纳米管结构，并共价接枝了血小板衍生生长因子-BB，结果显示，修饰表面显著增强了骨髓间充质干细胞的贴壁生长和成骨能力。

1.2.4 3D 打印构建

3D 打印可以精确控制表面形貌，并可在植入物表面精确整合磷酸钙、细胞因子等利于成骨的物质。Meenashisundaram 等[16]采用喷墨3D 打印和无压渗透技术，制备了具有优异压缩强度和细胞相容性的可局部降解Ti/Mg 复合材料，细胞评价显示其显著提高了成骨细胞的增殖率。Ma 等[17]通过3D打印制备了与骨缺损匹配的多孔钛合金支架，将该支架植入兔桡骨缺损模型中，发现其显著促进了血管化骨组织的形成，且新骨与植入物形成稳定结合。选择性激光熔化(selective laser melting，SLM)打印是一种常见的3D 打印方法[18]，但其产生的未熔化或部分熔化的颗粒附着在钛表面，易造成慢性炎症和骨溶解，为了解决这一问题并同时达到促成骨效果，研究者使用SLM 打印出多孔钛支架，并通过化学蚀刻和碱热处理去除附着的有害颗粒，体内结果显示，该表面显著提高了材料－骨组织界面处的骨整合程度[18]。

2 植入物感染的研究现状

骨科植入物植入后按照感染发生时间分为3 个月内的早期感染、3～24 个月的延迟感染和24 个月后的晚期感染[19]。预防植入物早期感染的关键是抑制微生物的黏附，防止延迟感染和晚期感染除了要抑制微生物黏附，还需保证抑制能力的持久性，本节将介绍早期感染防治策略和长效抗菌的研究进展(见图1(b))。

2.1 早期感染防治策略

早期感染通常由手术部位金黄色葡萄球菌(S.aureus)等病原体引发，患者需通过全身抗生素治疗来防治感染，但细菌对抗生素的耐药性、病灶部位抗生素富集量不足，导致细菌在植入物表面黏附、增殖并分泌细胞外聚合物形成生物膜[20]。生物膜一旦形成，其屏蔽效应会导致抗生素和宿主的免疫系统无法对内部细菌起效；因此，植入物表面防止感染的最佳途径是防止微生物的黏附和生物膜形成。

2.1.1 装载抗菌物质的表面构建

植入物表面装载抗生素已经被广泛研究，但由于细菌耐药性和单一抗生素抗菌谱窄等问题，限制了其临床效果。因此，具有广谱抗菌且不导致细菌耐药性的金属离子成为潜在的抗生素替代物被用于植入物表面修饰，如Ag＋、Cu2＋、Zn2＋等[3]。Chen等[21]利用多巴胺原位还原的方法在钛表面整合纳米银颗粒，发现该表面具有优异的抗菌能力，但Ag＋的强细胞毒性有待解决。Ye 等[22]在钛表面制备了锌掺杂涂层，非晶态的Zn-O 键可以控制Zn2＋的释放和活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，抗菌评价显示该表面具有强的S.aureus 杀灭能力。另外，虽然Zn2＋和ROS 均会造成细胞损伤，但该表面并未显示细胞毒性，故适宜的制备条件可以实现抗菌的同时不产生细胞毒性。

除了抗菌金属离子，一些非金属化合物和生物分子也是构建抗菌表面的新选择。氯己定是临床常用的一种抗菌冲洗药物[23]，杨园梦等[24]将氯己定接枝到多孔钛表面，结果表明，氯己定可抑制细菌的黏附并杀死细菌，且抗菌能力可保持7 d 以上，但同时也轻微抑制成骨细胞增殖。从腮腺分泌蛋白中提取的抗菌肽GL13 K 具有杀菌和抑菌作用，其D－对映体不易产生耐药性且不易被酶解[25]；Acosta 等[26]使用弹性蛋白样重组体将GL13 K 对映体接到钛表面，结果显示，涂层具有耐酶解能力和良好的抗菌活性，在模拟口腔环境中，有效破坏细菌细胞壁和抑制生物膜形成。

2.1.2 免疫功能调节表面构建

中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞可以吞噬微生物，在体内感染防治中具有重要作用，但种植体感染发生后，尤其生物膜形成，炎症细胞不但无法穿透生物膜以吞噬病原体，而且还会发生自溶并大量释放吞噬酶和活性氧，导致局部无效炎症反应并造成周围组织损伤[27]。Yang 等[28]利用磁控溅射在钛种植体表面制备钽纳米薄膜，发现该薄膜增强了中性粒细胞对细菌的吞噬能力、减少细胞自溶，并促进巨噬细胞释放促炎细胞因子和对细菌的吞噬。另外，为了减少炎症细胞引发的局部无效炎症，Li等[29]在钛表面沉积了具有抗菌和抗炎活性的氧化铈(CeO2)，CeO2降低了周围组织中TNF－α、IL－6和IL－1β 等促炎因子的表达并抑制生物膜形成，最终抑菌的同时降低了炎症对组织的损伤。

2.1.3 光动力治疗

TiO2是一种稳定的光催化剂，可在紫外线(ultraviolet，UV)照射下产生ROS 以杀灭细菌[30]，但UV 对人体有害。Nagay 等[31]通过钛的等离子体电解氧化法(plasma electrolytic oxidation，PEO)制备了掺杂氮和铋的TiO2涂层，其在可见光照下可以产生ROS 杀灭细菌。Wu 等[32]使用PEO 在钛表面制备了TiO2纳米陶瓷涂层，在可见光照射下杀死细菌、分解有机残留物，有效防止种植体周围炎的发生。但由于以上涂层均需可见光照射，故只适用于口腔种植体，对于体内较深部位骨科植入物的抗菌效果不佳。

2.1.4 光热治疗

近年来，基于近红外辐射的光热治疗(photothermal therapy，PTT)因创伤小、组织穿透深、选择性高等优点，成为纳米医学领域的应用研究热点[33]。PTT 可通过局部升温破坏细菌完整性或生物膜结构，但其无选择性的局部升温可能对该部位及周围的健康组织造成不利影响[34]。因此，与其他抗菌策略结合的PTT 更有应用潜力。Zhang 等[35]通过一锅合成法合成介孔多巴胺(mesoporous polydopamine，MPDA)，并将其与光敏剂吲哚青绿(indocyanine green，ICG)一同结合在钛表面，使用精氨酰－谷氨酰－天冬氨酸多肽(ARG-GLY-ASP，RGD)肽对钛表面进行修饰以增加生物相容性得到最终样品Ti-M/I/RGD(见图2)。利用MPDA 的光热转化实现钛表面涂层升温和灭菌、利用ICG 在光辐射下产生ROS 实现对细胞膜的破坏。该策略以远程可控的方式根除体内植入物表面已经形成的生物膜，避免清创手术或侵入性治疗，对周围组织的影响小。Song 等[36]在钛表面构建了多巴胺和二茂铁(dopamine and ferrocene，PDA-Fc)修饰的TiO2纳米棒抗菌涂层，利用PDA 的光热转化实现局部高温、利用PDA-Fc 氧化还原能力产生ROS，实现协同高效的杀菌性能。

图2 Ti-M/I/RGD 示意Fig.2 Schematic Illustration of Ti-M/I/RGD

2.2 长期感染的防治策略

由于骨科植入物在体内的留存时间较长，部分毒力较低的病原菌可能延迟到晚期阶段才引发感染[37]。此时病原菌已经形成生物膜，导致抗生素治疗效果不佳[38]，因此植入物表面具有长期抗菌性能非常必要。

2.2.1 抗菌金属缓释涂层构建

银离子是一种常见的广谱抗菌剂，但其快速释放会导致强细胞毒性[39]。研究者使用多种方法控制银离子缓释，实现长期抑菌且减少细胞毒性。Zhang 等[40]通过激光熔覆将混有Ag 和ZnO 的羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)纳米粉末沉积在钛表面，Ag＋和Zn2＋的长达5 周以上的联合释放使种植体具有长效抗菌力，并减弱了Ag＋的细胞毒性。Xie等[41]制备了一种含PDA、HA、纳米银的壳聚糖(chitosan，CS)涂层，PDA 与CS 的双重螯合实现了银的长期稳定释放，实现良好的长期抑菌效果、避免细胞毒性。然而此类涂层随时间延长释放抗菌物质逐渐减少、宿主的细胞或分泌的蛋白等逐渐覆盖植入物表面等因素，会导致植入物表面抗菌能力下降或消失，故如何实现长期稳定的抗菌效果仍是抗菌表面构建的重要研究内容。

2.2.2 抗菌肽和抗菌肽类似物

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMP)是一种天然抗感染剂，可与带负电的细菌细胞膜静电结合而穿透细菌，并触发机体免疫反应，表现出广泛的抗菌活性以及免疫调节能力[42]，其物理作用机制避免了药物耗尽的缺点，从而达到更长期的抗菌效果[43]。López 等[44]利用层层静电组装技术制备了装载β-肽(一种类抗菌肽)的壳聚糖和透明质酸聚电解质多层膜，通过对涂层化学交联可以实现β-肽长达8 周以上的控释并显著抑制S.aureus定植和生物膜形成。另外，该多层膜在被S.aureus连续攻击5 次后仍保持抗菌性，证明具有长期稳定性。

3 同时实现无菌性松动和感染的防治策略

促进骨整合和防治感染是骨科植入物的理想设计策略，但目前的植入物涂层大多都只具备其中之一，造成最终的治疗结果不理想。近年来，大量研究也开始逐渐聚焦同时满足两者要求的涂层构建(见图1(c))。

3.1 双因素结合

能同时解决无菌性松动和感染的涂层大多为双因素的结合，即将一种促进骨整合策略与一种抗菌策略相结合以实现涂层的双功能性。对钛表面形貌进行修饰并装载抗菌金属、抗菌肽等物质的涂层是目前最常见的多功能涂层构建策略。He 等[45]将PDA、阳离子抗菌肽LL－37 和磷脂包覆在经MAO 修饰的钛表面，LL－37 在磷脂的控释下通过扰乱细菌相关基因的表达和增强免疫反应实现杀灭细菌，同时被修饰的钛表面对间充质干细胞和成骨细胞均表现出良好的细胞相容性。

除了结合表面形貌与抗菌物质的策略，整合磷酸钙、阿仑膦酸钠等促成骨化合物和细胞毒性小的抗菌剂，同样能达到良好的双功能效果。甲基丙烯酸二甲氨基十二烷基酯(dimethylaminododecyl methacrylate，DMADDM)是一种新抗菌剂，其氨基和长烷基链可破坏细菌膜，对包括细菌耐药菌株在内的细菌和真菌具有强烈的抑制能力[46-48]。Zhou等[49]利用PDA 将DMADDM 和HA 整合到钛表面并将其植入大鼠骨髓炎模型中，结果显示，术后前4周逐渐释放的DMADDM 抑制了病原菌的黏附与增殖，4 周后表面诱导骨髓间充质干细胞成骨分化、促进植入物周围新骨的形成。Sung 等[50]使用聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷修饰钛种植体(Ti-AQ)后，共价偶联高效阳离子抗菌剂季铵化聚乙烯亚胺和对骨矿物质有较高亲和力的阿仑膦酸(见图3)。动物模型结果表明，该涂层可在早期抑制细菌感染，在后期增强骨整合。

图3 Ti-AQ 种植体示意Fig.3 Schematic Illustration of Ti-AQ

使用促成骨的活性分子结合抗菌物质或光动力治疗也可以实现促成骨和抗感染。Atefyekta等[51]利用共价固定和光交联分别将抗菌肽RRP9W4N 和含细胞黏附功能的多肽RGDC 结合到钛表面，结果显示，涂层同时实现促进了成骨细胞黏附和杀菌的目的。Huang 等[52]在钛表面制备了含有光敏剂红磷和精氨酸甘氨酸－天冬氨酸－半胱氨酸(arginine-glycine-asparticacid-cysteine，RGDC)的涂层，在红外线照射下红磷可产生活性氧杀灭细菌，RGDC 可以促进成骨细胞黏附和增殖。

3.2 三因素结合

为了更好实现抗菌和促骨整合，研究者将抗菌或促骨整合等3 种因素整合到一起以改善钛基植入材料的表面性能。Hengel 等[53]将银和锌纳米粒子紧密嵌入到3D 打印的多孔氧化钛层中，利用多孔结构和释放的Zn2＋促进成骨，Ag＋释放实现抗菌，这种协同机制降低了Ag＋对宿主细胞的毒性，但其机理尚不明确。Li 等[54]通过碱热处理获得多孔钛表面、通过多巴胺的螯合和原位还原构建了装载锶/银的多功能表面，结果显示，碱热处理涂层结构与骨小梁相似，改善细胞的黏附性、延伸性和分化，锶可调节成骨细胞功能和巨噬细胞的极化来促骨形成，银能够长期稳定释放并表现出良好的抗菌活性。此外，一些研究者设计了可随pH 改变而释放抗菌金属离子和成骨物质的涂层。Shen 等[55]在多孔钛表面沉积镁/锌，与2，5-二羟基对苯二甲酸(2，5-dihydroxyterephthalic acid，DHTA)配位形成金属-有机骨架(metal organic framework，MOF)涂层，在酸性环境下MOF 的溶解加快，逐渐释放的DHTA 和Zn2＋在种植体周围营造碱性微环境以杀死细菌并促进成骨细胞增殖，Mg2＋可提高成骨细胞活性和抗炎基因的表达。该涂层在植入初期具有很高的抗菌和抗炎特性，并促进了植入物周围的新骨形成。受此启发，若可设计出对pH、温度、细菌毒素等物质敏感的涂层，在适宜情况下释放抗菌和成骨物质，将会解决细胞毒性、细胞－细菌竞争性黏附等问题。

除上述方法外，研究者还找到了更为简便的实现抗菌和促成骨的面构建策略，即寻找一种同时具有两方面性能的物质或方法。来源于植物的黄酮类化合物被证明具有抑制生物膜的形成、抑制细菌毒性的能力，还可通过阻断外排泵逆转细菌的抗生素耐药性以增强抗生素疗效[56]，而其中的黄酮槲皮苷不仅具有抗菌特性，还能促成骨性和抗纤维化[57]。研究者在多孔钛合金表面制备了槲皮苷涂层[58]。该涂层不但阻止细菌黏附、抑制细菌活性，还提升了表面成骨能力。Vishnu 等[59]对酸蚀刻的钛表面进行水热处理，以生长出各向异性的纳米花特征氧化层结构，可导致细菌的机械损伤，并增加了成骨细胞的钙沉积，这种简易的改性方法在生物医学领域具有良好前景。Liu 等[60]合成了含成骨生长肽与环丙沙星的一种新型的抗菌成骨生长肽，并通过酰胺反应固定在钛基表面。体外评价显示，与未修饰的钛基质相比，该涂层不但抑制和杀灭了细菌，且促进成骨细胞黏附和成骨分化，但其体内抗菌和成骨性能还需进一步研究。固定一种可以同时实现抗菌和促成骨的成分，可能因功能构象改变或接枝量不足等问题，导致抗菌和促成骨的能力都不突出。

4 结论

解决无菌性松动问题和感染问题依然是目前种植体涂层的研究焦点。纵观近年对于解决钛种植体的无菌性松动或感染，以及同时解决两个问题的新策略，使用金属离子结合各种表面形貌技术、利用3D 打印技术制备的多孔材料实现抗菌或促进骨整合的方法已较为成熟，但金属离子大量快速释放所造成的细胞毒性、半衰期、稳定性有限等弊端不容忽视，可通过涂层控释、各组分间的协同作用等方法解决。此外，一些研究者将具有促成骨或抗菌性能的生物分子整合至涂层，在成骨或抗菌的同时提高生物相容性。对于多功能涂层的构建，大多研究者将促成骨的方法和抗菌方法结合，制备成双因素涂层，为了提高效果还会使用多因素制备涂层。但多因素在增强效果的同时，物质之间的相互作用也会增多，虽然目前大多为相互促进协同，但也有可能发生相互拮抗作用而造成构建失败。未来，同时具有抗菌和促成骨性能的新物质或表面修饰方法仍有待探索，操作简单、成本低廉、更具临床使用潜力等优点将使其成为研究的重点。