基因治疗中的核酸药物及非病毒递送载体的研究进展

刘 健

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院，北京 100005)

人类的很多疾病都与基因有着密切的关系，基因治疗是在核酸水平上对细胞生理机能进行干预的治疗技术，可通过导入正常基因以替代缺失或异常突变的基因，或抑制非正常的内源性基因的功能，对基因异常所导致的疾病进行治疗。此外，通过核酸水平的调控可以对目标细胞进行工程化改造，在原位产生有益的功能性蛋白[1]，从而实现基因-细胞联合治疗，这一策略在再生医疗、 免疫治疗、 RNA疫苗等领域具有重要的价值。

用于基因治疗的核酸类药物通常会编码特定的蛋白，或基于碱基互补原理对靶标基因进行调节。与传统小分子化学药物和抗体类药物相比，基于序列的核酸药物设计更为简单方便，而且受成药靶点的限制较少，对胞内和胞膜上的蛋白均可发挥作用。此外，在哺乳动物的基因组中，只有大约不足3%的DNA会最终表达为蛋白，而大量的非编码RNA(noncoding RNA)也在生命活动的调节中发挥着重要作用，因此，以核酸分子为靶标的核酸药物拥有更广的作用范围。但是，核酸类药物的临床应用面临很多的障碍，如体内稳定性差、难以高效进入靶细胞等。要发挥核酸药物的作用，通常需要利用合适的载体帮助核酸药物进入目标细胞并到达特定的胞内位置。因此，开发安全、高效的核酸递送系统是基因治疗成功的基石。

1 基因治疗中的核酸药物

核酸药物分为DNA药物和RNA药物，主要包括质粒DNA(plasmid DNA，pDNA)、反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)、小RNA(microRNA，miRNA)、短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)等[2]。近年来核酸药物获得批准的速度明显加快，其适应症也更加广泛，已有不同类型的核酸药物进入临床试验阶段，有望成为继小分子化学药物和抗体药物后的第三大类型药物。

1.1 基于RNA干扰的核酸药物

RNA干扰技术在2001年被《Science》杂志评为当时的十大科学进展之一。自1998年研究人员首次发现双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象以来，基于RNA干扰治疗方法的研究逐渐成为热点。RNAi是真核生物抵御外源基因入侵的一种天然防御机制，可以抵御病毒感染和转座子的插入。同时，RNAi也能够调控基因表达。迄今已发现siRNA、miRNA和shRNA可通过介导靶标mRNA的降解或抑制mRNA翻译，实现序列特异性的靶基因敲除。RNA药物的优点是不需要向细胞核内传递，插入宿主基因组的风险低，主要缺点是稳定性低和较高的免疫原性风险。

在可介导RNAi的各种核酸分子中，siRNA是最常见的一类。siRNA是一种双链RNA，长度一般在21～23个核苷酸左右，可以直接导入细胞，也可由长双链RNA或shRNA在胞内通过核酸酶Dicer切割生成。进入胞内的siRNA会与Argonaute蛋白及Dicer组成沉默复合物(RISC)，并解开成为单链。之后可以引导RISC识别并切割与其互补的靶mRNA序列，使其降解，从而导致特定靶基因的敲除[3]。2018年8月10日，美国食品和药物管理局(FDA)批准了第一个siRNA药物patisiran(Onpattro)，它是一种作用于肝脏的siRNA，用于治疗遗传性转甲状腺蛋白淀粉样变性(hATTR)引起的多发性神经病[4]。2019年11月第二款RNAi药物givlaari获得批准进入临床，用于治疗急性肝性卟啉症(AHP)[5]。2020年有两款新的siRNA药物获得批准，分别用于原发性高草酸尿症[6]及成人高胆固醇血症的治疗[7]。此外，还有用于肝脏、肾脏和眼部适应症的多种siRNA候选药物正处于临床试验的不同阶段。siRNA药物属于人工制备的外源性siRNA，其主要问题是进入机体后可能会引起免疫反应，导致干扰素及炎性因子的产生，或由于“脱靶效应”而导致正常功能基因的表达沉默。通过对链端或核苷进行适当的化学修饰(如反义链5’端的甲氧基化修饰等)，可在一定程度上减少这些不良事件的发生。

除siRNA外，单链的miRNA也可以调节mRNA的翻译，进而调节细胞的分化、增殖等过程，目前已发现约2 000种内源miRNA。miRNA的异常与肿瘤等多种疾病的发生密切相关[8]。miRNA药物可分为拮抗剂(antagonist)及模拟物(mimics)两类。前者通过碱基互补配对与内源miRNA结合，并通过RISC对miRNA进行降解或阻碍其翻译，从而抑制其功能；后者的序列与人体内具有正常功能的miRNA类似，将其导入miRNA缺失的靶细胞，可使细胞恢复正常生理功能。尽管自miRNA发现至今已有约20年的时间，有部分miRNA药物的研发已进入临床试验阶段，但尚未有药物获得批准进入临床使用。

1.2 基于反义核酸技术的核酸药物

反义核酸包括反义RNA和反义DNA，是指能与特定mRNA或DNA精确互补，从而特异阻断其翻译或转录的核苷酸片段。反义RNA与靶标mRNA结合后，通过空间位阻效应阻止核糖体与mRNA结合，或抑制转录后mRNA的加工修饰，并能够激活内源性RNase降解mRNA，从而抑制靶蛋白的翻译；反义DNA通过与基因DNA双链的调控区特异结合形成DNA三聚体(triplex)，或与DNA编码区结合，从而抑制转录的顺利进行。目前应用最多的反义核酸药物是包含15～25个核苷酸的单链寡聚核苷酸(ASO)，自1978年被报道之后，已有多款药物被批准用于杜氏营养不良症、家族性高胆固醇血症、脊髓性肌萎缩症等疾病的治疗，是当前获得批准药物数量最多的一类核酸药物[9]。

1.3 编码蛋白的核酸药物

质粒是应用最广泛的一类基因导入工具，多为环形双链DNA，存在于胞质中，能够自行复制，是细胞内独立于染色体外的遗传物质。相对于借助病毒的基因导入技术，质粒具有易于生产、免疫原性低、安全稳定、使用方便等优点，使其成为基因治疗中极为重要的一类药物。自1995年以来，获得批准的基因治疗试验方案中大约有25%使用了质粒DNA[10]。质粒不仅可以编码蛋白，也可以编码mRNA、miRNA或siRNA等其他功能性RNA药物，甚至可以同时编码多种不同类型的药物，从而能为基因治疗提供更多的选择方案。但是，质粒DNA通常分子尺寸较大，这为其向胞内的递送增加了一定的困难。

另一种在细胞内表达功能性蛋白的方法是利用mRNA。与质粒相比，直接将编码特定蛋白的mRNA转入细胞，可以跨过转录步骤直接进行翻译表达，对于只需要一过性蛋白表达的场合更加直接方便。在COVID-19疫情暴发之后，基于mRNA的核酸疫苗技术在疫情防控中发挥了重要的作用，充分显示了mRNA疫苗在时效性及有效性上的优势。基于mRNA疫苗技术的mRNA-1273是全球最先进入临床试验的新冠疫苗，Ⅲ期临床的最终分析数据显示，其对COVID-19的保护效力能达到94%；另一款mRNA疫苗BNT162b2在Ⅲ期临床中同样显示了对COVID-19高达95%的保护效力[11-12]。此外，在肿瘤免疫治疗领域，个性化癌症疫苗mRNA-4157与检查点抑制剂疗法的结合在多种实体肿瘤中显示了良好的抗癌潜力，在Ⅰ期临床中对头颈部鳞状细胞癌的的总缓解率(ORR)达到50%，而单独使用检查点抑制剂治疗的ORR仅有14.6%[13]。

1.4 基于基因编辑技术的核酸药物

通过基因编辑技术对细胞进行改造可能是实现基因长期稳定表达或完全敲除的最佳手段之一。用于基因编辑的工具主要包括锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription-activator like effector nuclease, TALEN)和 CRISPR/Cas系统。其中CRISPR/Cas系统在效率、速度和成本方面均具有明显优势，可以在人类基因组中引入精确的编辑，特别是CRISPR/Cas9作为核酸药物的应用研究最为广泛，被用于CAR-T细胞治疗、高胆固醇血症、镰状细胞贫血、地中海贫血和杜氏肌营养不良等多种疾病的治疗[14-15]。

与其他单一核酸药物不同，CRISPR/Cas系统至少需要将引导RNA(gRNA)和Cas9核酸酶两个组件(进行基因插入时还需要模板RNA)按一定比例传递到细胞中才能发挥最佳的基因编辑效率，实现基于非病毒载体的安全高效递送非常具有挑战性[16]。CRISPR/Cas除了可以直接使用Cas蛋白，还可以选择使用编码Cas蛋白的mRNA，或者使用同时编码Cas和gRNA的单个质粒，在胞内通过转录/翻译转化为具有活性的gRNA及Cas核酸酶[17]。有研究报道利用带有二硫键的脂质纳米颗粒(BAMEA-O16B)在体内递送Cas9 mRNA和sgRNA可实现约80%的高编辑效率[18]。

2 核酸药物载体

核酸药物在体内的应用面临多重挑战。首先，由于体内存在大量核酸酶，核酸分子很容易被降解，难以单独进行全身性给药，极大影响了核酸药物的成药性。其次，核酸药物必须进入细胞质或细胞核才能发挥作用，而核酸分子尺寸通常较大，亲水性很好，且因分子链中存在大量磷酸根，在正常生理pH条件下带负电荷，很难穿透细胞膜进入细胞。因此，核酸药物递送载体及相关递送技术的发展是基因治疗技术实现临床应用的重要基础。

核酸载体一般可分为病毒性载体和非病毒性载体两大类。常见的病毒性载体包括腺相关病毒、慢病毒、腺病毒和逆转录病毒等，由于利用了野生型病毒固有的能力，因而可以高效转染细胞[19]。目前大多数的细胞和基因治疗项目所采用的载体都是病毒载体。但病毒载体对核酸分子的尺寸有限制，而且需要复杂的制备过程，成本较高，更重要的是可能存在免疫原性、致癌性等安全隐患[20]。非病毒载体具有更高的安全性，但其缺点是转染效率较低。近年来，随着转染效率、特异性和安全性的改进，临床试验中非病毒载体的数量逐渐增加[21]。常见的非病毒载体包括阳离子脂质、阳离子高分子和多肽等，这些阳离子型的载体在正常生理pH条件下带正电荷，可以与带负电荷的核酸分子形成复合体，通过对核酸分子进行压缩而减小其分子尺寸，并提供足够的保护以对抗核酸酶。同时，复合体表面多余的正电荷可以使复合体更容易接近带负电荷的细胞膜，促进核酸分子进入细胞，并可通过质子海绵效应帮助被内吞的核酸分子从溶酶体中逃逸而进入胞质(图1)，这一理论近年来已得到了一些影像学证据的支持[22]。

图1 阳离子型载体介导的基因转染Fig 1 Gene transfection mediated by cationic carriers

2.1 阳离子脂质

阳离子脂质易于合成且转染过程相对简单，是最常见的一类非病毒基因递送载体。尽管用于基因递送的阳离子脂质分子具有不同的化学结构，但从结构上看，基本都由极性头基、疏水尾部和连接子构成。最普遍的阳离子头基是各种胺基，而疏水尾部则通常由脂肪链或胆固醇等组成，疏水结构域与极性头基之间由酯键、醚键等连接。每一个结构域在核酸药物的传递过程中都起着关键作用，且都可以通过适当地调整来优化载体的性能，例如，通过改变连接子，可调控脂质分子的稳定性、转染效率和生物相容性[23]。阳离子脂质可以通过静电吸附及自组装与核酸分子形成脂质/核酸复合物，保护核酸分子和促进内吞，并帮助核酸分子从溶酶体逃逸，其转染效率取决于脂质类型、构成及脂质/核酸电荷比[24]。虽然单一成分的阳离子脂质也可以作为核酸载体，但更普遍的方法是与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和胆固醇等辅助脂质配合使用，以调节脂质体的稳定性，帮助脂质/核酸复合物的形成，并促进脂质体与细胞膜的相互作用[25]。

2.2 脂质纳米颗粒

脂质纳米颗粒(LNP)是另一种广泛使用的非病毒基因递送载体，易于加工并可稳定储存，与阳离子脂质具有相近的转染效率，并且易于通过功能化修饰而提高细胞靶向、内化及介导基因转染的能力[11-12]。球状囊泡结构的LNP多由可电离的阳离子脂质(ionizable lipids)、中性辅助脂质、胆固醇、聚乙二醇修饰的脂质(PEGylated lipid)构成。如首个mRNA疫苗mRNA-1273所使用的载体由一种可电离阳离子脂质(SM-102)与三种商业化脂质(DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG)组成[26]。成分中的中性辅助脂质一般为饱和磷脂，能促进层状脂质结构的形成及稳定；胆固醇有较强的膜融合性，可促进mRNA内化和进入胞质；PEG化脂质用于免疫逃逸和增加稳定性；最关键的可离子化脂质在生理pH值下保持中性，以降低其毒性和免疫原性；在低pH值下则带正电荷，从而能通过静电力与核酸相互作用，并在被细胞内化后实现溶酶体逃逸。国际上首个获得批准的RNAi治疗药物也同样使用了脂质纳米颗粒[27]。此外，脂质纳米颗粒可以用来递送CRISPR/Cas9组分，在动物模型体内实现了基因组编辑[28]。目前批准的脂质纳米颗粒在储存运输和使用等方面还存在不足之处，比如需要在低温下才能长期保存。

2.3 阳离子聚合物

基于合成或天然阳离子聚合物(CP)的核酸递送系统在基因治疗技术开发中受到大量关注。常见的包括聚乙烯亚胺(PEI)、多聚赖氨酸(PLL)、壳聚糖等。CP具有较高的正电荷密度，可与带负电荷的核酸分子相互作用，对核酸分子进行压缩，形成尺寸较小的聚电解质复合物(PIC)[29]；同时，可以提供强大的pH缓冲能力，有利于复合物从内体逃逸[22]。除了线性高分子外，树枝状聚酰胺胺(PAMAM)、聚丙烯亚胺(PPI)等具有纳米尺度和径向对称性的三维树状结构大分子也经常被用于核酸药物载体，其优势在于可以通过吸附介导的细胞内吞作用促进内化，通过表面胺基有效压缩核酸并保护其不被酶降解，同时通过核心大量的三级胺基提供pH缓冲能力[30]。

PEI、PDMAEMA和PLL等常用CP都是不可降解的，且具有较强的细胞毒性，从而严重限制了其应用。通常认为CP细胞毒性与其分子尺寸及正电荷密度相关[31]。具有高分子量和电荷密度的非降解性CP可能在细胞中积累，最终导致高细胞毒性；而低分子量及低电荷密度的CP虽然更易于被清除，毒性较低，但会降低其压缩核酸分子的能力，影响转染效率。如低分子量PEI(～600 Da)毒性较小，但其转染效率远低于常被作为金标准的25 kDa支链PEI。因此，如何在毒性及转染效率间取得平衡是CP设计所面临的主要问题。Ding等通过在可生物降解的聚乳酸(PLA)分子上导入支链PEI合成了PEI-PLA共聚物，克服了PEI的毒性和不可降解的缺点，在有血清存在的情况下仍显示了较高的转染效率[32]。此外，Wu等将含有组氨酸和赖氨酸的连接子(linker)与低分子量PEI (600 Da)分子偶联，合成了高分子量共聚物，使其获得了较低的毒性及较高的转染效率[33]。

另一种策略是使用可生物降解的聚合物，特别是明胶、白蛋白、壳聚糖(CS)、透明质酸(HA)、葡聚糖和β-环糊精(β-CD)等天然来源的蛋白或多糖分子[34]。这些生物可降解高分子在生物相容性方面具有较好的优势，而且具有与特定组织或细胞的天然亲和性，如肿瘤细胞高表达HA受体，肝脏细胞高表达脱唾液酸糖蛋白受体等，因此可以实现一定的靶向递送效果。由于多数天然高分子缺乏足够的正电荷，为了负载核酸分子，通常需要进行阳离子化改性[35]。除了利用CP与核酸分子的自组装作用，还可以利用预先制备的具有特定尺寸及空间结构的高分子基纳米材料(如颗粒、凝胶、胶束等)来负载核酸分子，并实现被动靶向、环境响应、缓控释等功能[36]。此外，使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等非正电性的纳米颗粒来装载DNA质粒等核酸药物有可能避免阳离子带来的细胞毒性[37]。

2.4 无机纳米颗粒

无机纳米颗粒种类繁多，金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、磁性纳米颗粒、碳纳米管、量子点等材料已得到了大量的研究[38]。无机纳米颗粒易于进行表面修饰改性，由此可对其降解性、生物相容性、免疫原性、核酸负载能力等进行优化。除了可以负载核酸分子，无机纳米颗粒通常具有独特的多功能性，使其介导的基因递送成为一种有吸引力的策略。如量子点在进行核酸递送的同时，可以作为一种高效的荧光探针，实现核酸标记和体内动态分布的实时跟踪[39]；氧化铁磁性纳米颗粒可在磁场作用下更高效地接近并进入细胞，实现高效的磁转染(magnetofection)[40]，还可以实现磁诱导的细胞/组织靶向及磁共振成像[41]；此外，金纳米颗粒的光热效应使其可以触发核酸药物的释放[42]，或实现光热/基因联合治疗[43]。

2.5 外泌体

外泌体是由细胞自然分泌的胞外囊泡，直径一般为40～160 nm，具有脂质双分子膜结构，内部含有蛋白质、脂类、DNA和RNA等细胞成分。外泌体是细胞间通讯的纽带，可以包裹胞内生成的信息素并将其传送到其他细胞内，从而控制细胞集落有序生长。因此，外泌体不仅具有生物相容性，而且不易被免疫清除，使其具有作为基因传递载体的天然优势[44]。与脂质体相比，外泌体的组成更为复杂，而且脂膜富含蛋白质，能够实现特异性靶向，并具有更高的稳定性。然而，由于外泌体的生产及分离纯化较为繁复困难，限制了其作为基因传递载体的广泛应用[45]。

2.6 核酸偶联物

与脂质及高分子复合物等载体系统相比，核酸药物与胆固醇、多肽、抗体、核酸适配体或各类小分子直接连接形成的核酸偶联物具有体积较小、免疫原性较低、不易被机体清除的特点，且可通过偶联分子改变核酸药物的体内分布及代谢动力学等性质，帮助核酸进入到特定的组织和细胞内[46]。核酸偶联物中最成功的是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)修饰介导的肝靶向递送系统，其可与肝细胞上高表达的脱唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)受体结合，介导高效率的内吞作用。目前已有3款基于GalNAc技术的核酸药物获得批准进入临床应用[47]。但核酸偶联物中的核酸分子通常缺少必要的保护，如何增强核酸分子在生理环境中的稳定性是其面临的关键问题。研究表明，通过在核苷酸的2’位置进行化学修饰，以及用硫代磷酸键取代磷酸二酯键等方法，可大幅改善核酸偶联物对核酸酶的稳定性[48]。此外，分子间连接子的设计及修饰位置也是重要的因素。如采用环境敏感的linker，还可以使核酸偶联物进入细胞之后与偶联物脱离；在siRNA中心部位导入偶联分子会获得更为有效的RNA干扰效果[49]。

3 影响核酸药物递送效率的关键问题和对策

基因治疗的成功与否，很大程度上依赖于能否以安全的方式将核酸药物有效输送到体内的目标细胞中。根据靶器官和给药途径的不同，核酸药物及其载体需要克服多重生物学屏障[50]，整个过程中仍存在大量的关键性技术难点。

3.1 增强核酸药物的稳定性，增加体内循环时间

核酸药物需要保证在未降解情况下到达目标器官/组织/细胞。但由于各类核酸酶的存在，核酸分子在体内环境中的半衰期非常短。通过对核糖、磷酸骨架、碱基以及核酸链末端等进行化学修饰可增加核酸药物的稳定性[48]。此外，利用阳离子脂质、阳离子高分子的压缩和包裹也可以较好地实现对核酸分子的保护[29]。

核酸复合物在细胞外环境中不稳定性和网状内皮系统介导的免疫清除也是非病毒基因载体面临的问题。引入DOPE和胆固醇等中性辅助脂类可以增强阳离子脂质/DNA复合物的胶体稳定性[25]。此外，聚乙二醇修饰可以减少纳米颗粒的聚集，提高其稳定性，并可显著提高非病毒基因载体的免疫逃逸能力，使其不易被网状内皮系统清除[51]。除了阳离子高分子，亲水性的中性聚合物如聚乙烯醇吡咯烷酮也可与核酸分子形成可逆的中性或阴离子复合体，抑制核酸酶的降解作用[52]。

3.2 改善核酸药物进入特定组织的能力

在全身性给药的情况下，进入血液的核酸药物需要跨越血管内皮屏障才能够进入目标器官或组织。特别是对神经系统疾病的基因治疗而言，要使核酸药物通过血脑屏障(BBB)进入大脑存在很大挑战。通过在载体表面修饰特定的靶向分子，如转铁蛋白受体的抗体、瘦素等可以帮助其跨越血脑屏障[53]。此外，利用氧化铁纳米颗粒联合外部磁场可暂时破坏内皮细胞间连接，激活细胞旁运输途径，从而增加血管内皮的通透性[54]。

实体肿瘤组织中的血管系统虽然通透性较强，但药物必须穿过致密的细胞外基质(ECM)，并克服高间质流体压力才能到达深部的肿瘤细胞。通过高通透性和滞留效应(EPR效应)富集到实体肿瘤的纳米颗粒的最佳尺寸通常为100～200 nm，但要实现向肿瘤内部扩散，这一尺寸却又过大了。尺寸可动态改变的纳米载体是一种可行的技术，如利用近红外光触发大小可调的脂质体，不仅延长了血液循环时间，而且脂质体由大(～162 nm)变小(～8.6 nm)后，可促进其向肿瘤深部渗透[55]。此外，有研究表明，带有正电荷和特定配体修饰的纳米药物可基于细胞转运实现肿瘤内的穿透，不需要克服ECM的阻碍[56]。

3.3 高效进入细胞

由于核酸药物必须进入细胞内部才能发挥作用，因此，穿过细胞膜是其面临的重大挑战。吸附性内吞作用、受体介导的内吞作用、巨胞饮作用和吞噬作用是非病毒基因载体被细胞摄取的主要途径。裸核酸分子的负电性会妨碍其与细胞膜的结合，采用阳离子化载体可以中和核酸分子的负电荷，增强其与细胞膜的结合[29]。一般认为，阳离子载体与细胞膜上的硫酸肝素蛋白多糖(HSPGs)的相互作用会促进核酸复合物的内吞。通过精确调控载体的理化学性质，如表面电位、形状、尺寸、软硬度，可以影响细胞对载体的内吞能力[28]；在载体表面修饰细胞特异性配体可显著增强其在细胞表面的结合[47, 49]。此外，超声、激光脉冲、电穿孔等物理性辅助技术也可以促进遗传物质向细胞内传递[57]，但目前为止只有少数应用于临床的报道[58]，低通量、侵入性及操作限制应该是主要原因之一。将微针与电穿孔技术结合的微创电极等研究有助于推动物理性转染技术的临床应用[58]。

3.4 溶酶体逃逸及胞内解离和定位

核酸药物载体主要以内吞方式进入细胞，并最终转运至溶酶体中。如不能尽快从溶酶体逃逸进入到胞质中，将面临酸性(pH值约4.5)和各种水解酶的严酷环境，从而被迅速降解失活。内体/溶酶体逃逸始终是提高非病毒载体转染效率的瓶颈之一。阳离子脂质/DNA复合物可以通过与内体膜融合而从内体中逃逸，其机制可能是阳离子聚合物介导的内体的物理破坏或质子海绵效应[22]；其他常见的策略包括借助光热、磁热等物理信号刺激[59]，或利用氯喹、蜂毒肽等辅助性药物，增加溶酶体的不稳定性或诱导溶酶体膜通透化[60]，但需要考虑如何避免溶酶体失稳及破裂所带来的细胞毒性。

进入到胞质中的核酸分子需要及时与载体分离，以发挥其生物效应。在阳离子脂质/核酸复合物中，带正电荷的脂质与内体的膜融合有助于核酸分子的释放，而阳离子聚合物通常被认为更难发生核酸释放。通过分子设计在载体中引入还原响应性基团是一种可行的策略，如使用双硫键交联的载体。由于双硫键在细胞内的高还原性环境下(谷胱甘肽的浓度比细胞外环境中高出约50～1 000倍)会发生断裂，有助于核酸分子释放到胞质中[61]。Nie等借助双硫键的还原响应性制备了在胞内发生电荷逆转的Hep@PGEA载体，可自加速释放编码CRISPR/Cas9的质粒DNA，用于原位肝细胞癌的治疗[62]。与此类似，Fang等利用对ROS/GSH更为敏感的二硒键交联的精胺长链(dPSP)与质粒DNA自组装成纳米颗粒，并同时负载吲哚菁绿(ICG)， ICG能在近红外光下产生单线氧，促进dPSP中二硒键的降解，从而诱导外源基因的有效表达，同时降低细胞毒性[63]。

对于DNA药物而言，进入细胞核是最后一个重要的限制性步骤，通常只有一小部分DNA能成功进入细胞核。因此，研究DNA核转位机制以加强这一过程，对提高非病毒基因传递效率至关重要。在分裂活跃的细胞中，核膜在有丝分裂过程中解体时会允许DNA进入，但在非分裂细胞中，大尺寸的DNA分子可能需要通过添加核定位序列(NLS)，或在DNA分子上共价修饰NLS多肽等分子，以增强其进入细胞核的能力[64]。为了获得良好的效果，通常需要多种策略组合。如Tan等开发了一种核-壳纳米平台用于将基因靶向传递到视网膜，其内核由氨基酸功能化的树状大分子和核定位信号(NLS)组成，通过静电相互作用将内核包裹在pH敏感的脂质双分子层中，并以HA-DOPE为最外层涂层。在该纳米平台的帮助下，DNA可以扩散到视网膜，被细胞内化，从核内体逃逸，最终通过NLS运输到细胞核[65]。

3.5 蛋白吸附

阳离子型载体的正电荷是一柄双刃剑，正负电荷的相互作用虽然有利于提高转染效率，但也导致阳离子型载体容易与各类细胞非特异性结合；同时，带正电荷的复合体还容易吸附大量蛋白，在表面形成蛋白冠，不仅会导致复合体的电荷及尺寸变化、导致复合体的不稳定，还会阻碍递送载体对靶细胞的识别[66]。通过深入理解血清对阳离子载体转染的影响规律，可以有效指导载体系统的设计[67]；此外将阴离子化高分子通过静电自组装方式在阳离子型核酸递送系统外形成负电性外壳，使用蛋白预包被、或直接利用白蛋白等生物蛋白分子作为核酸载体等策略，也可以减少血液中血清成分的影响[68]。

4 总结及展望

尽管非病毒载体介导的核酸转染能力有了显著的提高，但与病毒载体相比仍有较大差距，目前在临床试验中占主导地位的依旧是病毒载体。随着新型核酸药物的开发和非病毒递送技术的不断进步，基因治疗及基因-细胞联合治疗实现大规模临床应用的曙光已经开始展现。由于核酸药物的种类众多，作用机制各异，分子尺寸千差万别，期待采用一种“通用性”载体解决所有核酸药物递送问题是不现实的。在进入临床的核酸药物中，寡聚核苷酸药物对载体的需求并不强烈，但siRNA分子则高度依赖载体。此外，核酸药物尺寸是设计递送载体时必须考虑的另一个关键因素，miRNA、siRNA等小核酸药物可以采用直接偶联的简单剂型，质粒DNA、mRNA等尺寸较大的核酸药物(通常长度大于200个核苷酸)则更需要载体的压缩及包裹；小核酸分子在形成稳定的复合体时需要载体有较高的正电荷密度，而大尺寸核酸药物对载体电荷密度的要求较低。由于递送过程的不同阶段对载体的要求有很大差异，智能型、环境响应性载体将具有更大的优势。未来的核酸治疗药物的设计有很大可能会走向个体化定制的道路，而核酸载体的研发必然会与之相匹配，标准化、系列化、可床旁调制的核酸递送载体将是未来发展的重点。