盐胁迫下木麻黄幼苗对外源钙的生长生理响应＊

陈利全 黄灿雄 苏以强

（惠来县生态公益林管理中心，广东 惠来 515200)

木麻黄Casuarina equisetifolia属木麻黄科木麻黄属植物，具有早期生长迅速、材质优良、耐盐抗旱能力强等特性[1-2]，因此被我国华南和东南沿海地区作为重要的生态防护和造林用材树种，对防御海浪侵蚀、减少台风侵害起到不可替代的作用[3-5]。然而研究发现，木麻黄幼龄期盐敏感性较强[6-8]，在盐浓度较高的沿海滩涂地区种植时，早期盐害现象较为明显，育林成效普遍不高[9]。

盐胁迫是自然界中最为常见的一种逆境胁迫，能导致植物产量、生理代谢及分子水平等系列复杂的变化，有关盐对植物生理生化的影响以及植物耐盐适应机制一直被视为研究工作中的重点和难点[10-12]。钙是植物生长生理代谢活动中的第二信使，是一种重要的调节物质之一[13]。前人研究发现，外源钙能有效缓解盐胁迫对植物的伤害，但目前有关外源钙对缓解木麻黄幼苗盐害方面的报道尚鲜少见[14-18]。基于此，本试验以木麻黄幼苗为研究对象，探讨盐胁迫下外源钙对木麻黄幼苗生长生理方面的影响，旨在揭示外源钙在缓解木麻黄盐害方面的潜力及其作用机制，以期为今后沿海木麻黄的高效培育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

种子采自广东省惠来县木麻黄防护林，晾晒后选取颗粒饱满的种子经催芽、萌发后，移至装有基质（泥炭土、珍珠岩、蛭石按等体积比混匀）的容器杯中，待苗木培育3 个月后，选取生长健壮、长势较好、苗高10 cm 左右的苗木放在1/2 Hoagland 完全营养液(Hoagland 和Arnon 1950)中进行水培备用。

1.2 试验方法

1.2.1 胁迫处理 适应性培养半个月后，参考前人方法进行盐胁迫和外源钙交互作用处理[19-20]。其中，盐胁迫处理设置0（S0）、40（S1）、80（S2）、120（S3）、160（S4）mmol·L-1NaCl 5 个梯度，每个盐梯度下设置0（C0）、15（C1）、30（C2）mmol·L-1CaCl23 个 处 理， 共 计15 个 处理，每处理重复4 次，每重复30 株苗。以S0C0（0 mmol·L-1NaCl+ 0 mmol·L-1CaCl2） 为 对 照（CK），观测15 个处理生长生理指标变化。各处理苗木均置于人工控制环境条件的生长室进行，光 照 强 度450 μmol·m-2·s-1、光 照12 h、温 度28±0.5 ℃、相对湿度80 %，每周换1 次营养液，每日早晚各充气1 次，每次充30 min。

1.2.2 指标测定 当幼苗胁迫处理4 周后，进行生长与生理指标的测定。其中，依据15 个处理生长指标观测结果，确定120 mmol·L-1NaCl（S3C0处理）为本试验供试木麻苗幼苗的盐害阈值、25 mmol·L-1CaCl2为该盐浓度处理下最佳钙缓解浓度（S3C1 处理）。因此，以S3C0 和S3C1 处理为研究对象，进一步分析木麻黄幼苗根系离子微区分布、叶片钙离子亚细胞定位与质膜透性的变化。

存活率：分别统计各处理存活苗木数量，根据存活株数占初始总株数百分比计算存活率。

盐害率：以胁迫处理4 周后对照处理苗木存活率为参照，根据对照处理苗木存活率和各盐处理苗木存活率的差与对照处理苗木存活率的比值计算盐害率[21]，即：盐害率（%）=（对照处理苗木存活率-盐处理苗木存活率）/对照处理苗木存活率×100。

根系离子微区分布：截取植株根尖进行横切面的徒手切片，样品直径长1 mm、厚0.3 mm。然后将样品平铺于贴有导电胶带的铜板上，每处理放4 个样品，自然晾干后喷镀碳膜。于德国LEO 1530VP 型可变压力场发射扫描电子显微镜下观察，用英国OXFORD INCA-300 型X-射线能谱仪分析，加速电压20KV，样品倾角0°。以Na+、Cl-、K+、Ca2+、Mg2+为分析离子收集谱线能谱图。利用计算机附带软件，自动判读根部表皮、皮层和中柱各离子相对百分含量。

叶片Ca2+亚细胞化学定位：将叶片切成3 mm× 5 mm 大小后投入到2.5%（V/V）戊二醛加4%（V/V）多聚甲醛的混合固定液中，真空抽气1 h 后置于25 ℃黑暗条件下固定6 h。用2%（m/m）焦锑酸钾磷酸缓冲液（pH 7.6）清洗4 次后转至1%锇酸中固定10 h，清洗干净后进行系列梯度酒精脱水，梯度丙酮过渡，Epon812 树脂渗透。然后Epon812 包埋过夜，35 ℃聚合12 h，45 ℃聚合12 h，60 ℃聚合48 h。最后采用超薄切片机切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察并照相。对照切片的处理：将在电镜下已确定有焦锑酸钙沉淀的切片，漂浮在100 mmol/L 的EGTA（pH 8.0）溶液中，60 ℃处理0.5～l h，使EGTA 与Ca2+鳌合，脱去沉淀中的Ca2+再置于电镜下观察照相，如果原黑色沉淀区域表现出与其形状相同的透明区域，则证明以切片中黑色沉淀作为Ca2+定位来反映的Ca2+分布区域是真实可信。

叶片质膜透性指标测定：相对电导率采用电导法，膜脂过氧化物丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法进行测定[22]。

1.3 数据处理

数据采用SPSS19.0 统计分析软件进行处理分析，运用Duncan 新复极差法进行多重比较，两个处理间差异性检验采取t-test（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 外源钙对盐胁迫下木麻黄幼苗生长的影响

本试验供试木麻黄幼苗表现出了较强的盐敏感性，加之盐处理时间仅为4 周，除对照外，各处理苗高、地径、生物量等生长指标增量变化不明显。鉴于此，为确定木麻黄幼苗的盐害阈值，该试验选择以幼苗存活率作为判断不同盐浓度处理下木麻黄遭受盐害的生长指标。由表1 可知，不同盐浓度处理木麻黄幼苗存活率差异显著，其中在盐浓度为0～80 mmol·L-1时，存活率约为90%～100%、盐害率0%～10%，而浓度达到120 mmol·L-1时，存活率为49%、盐害率51%，当浓度增至160 mmol·L-1时，苗木基本已完全死亡，存活率仅为3%、盐害率达97%。这说明，120 mmol·L-1NaCl 可作为本试验供试木麻黄幼苗的盐害阈值。从各盐浓度处理下外源钙的缓解效果来看，较低盐浓度（0～120 mmol·L-1）范围内附加15 mmol·L-1CaC12时，幼苗存活率最高、盐害率最小，而盐浓度为160 mmol·L-1，则以30 mmol·L-1CaC12缓解效果最好，存活率增加975.4%、盐害率降低28.4%，这反映了外源钙能有效缓解木麻黄幼苗在盐胁迫下遭受的损害程度。综合各盐处理的钙缓解效果来看，以120 mmol·L-1盐处理下15 mmol·L-1外源钙（S3C1）的效果最好，存活率由48.6%提升至92.8%，盐害率降低程度最大，下降了86.9%，仅为6.7%，与未加钙120 mmol·L-1盐处理（S3C0）相比差异尤为显著。

表1 外源钙对盐胁迫下木麻黄幼苗存活率及盐害率的影响Tab.1 Effects of exogenous calcium on survival rate and salt injury rate of Casuarina equisetifolia seedlings under salt stress

2.2 外源钙对盐胁迫下木麻黄幼苗生理参数的影响

2.2.1 根系离子微区分布的变化 为进一步分析盐胁迫下外源钙的缓解作用机制，基于生长指标观测结果，笔者重点分析了钙缓解效果差异显著的S3C0 和S3C1 处理下木麻黄幼苗生理参数的变化。植物遭受盐害主要是通过影响根系对离子的选择吸收。由图1 可知，在S3C0 处理下根系表皮、皮层、中柱中Na+、Cl-相对含量为30.1%～61.3%，而K+、Ca2+、Mg2+仅 为1.1%～6.1%， 但 在S3C1处 理 下，Na+和Cl-分 别 降 至2.7%～5.0% 和20.0%～38.1%，K+、Ca2+、Mg2+分 别 增 至27.6%～38.8%、25.1%～30.8%和3.8%～8.1%。

图1 S3C0 和S3C1 处理下木麻黄幼苗根系离子分布X-射线微区分析图谱及相对含量Fig.1 X-ray microanalysis spectrum and relative content of root ion distribution in Casuarina equisetifolia seedlings under S3C1 and S3C0 treatments

从加钙前后根系微区各离子相对含量变化幅度来看，加钙后Na+、Cl-分别降低了89.6%和44.7%，而K+、Ca2+、Mg2+分别增加了2 048.7%、385.5%和279.8%（图1）。这说明，外源钙对盐离子毒害作用的缓解主要是通过影响Na+、K+、Ca2+、Mg2+间的平衡来实现的。从表2 中Na+与K+、Ca2+、Mg2+离 子 比 例 在S3C0 和S3C1 处 理下的差异来看，S3C1 处理下表皮、皮层、中柱中K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+的比值均大于S3C0处理。从两种处理下3 种离子比例大小来看，在未加钙S3C0 处理下Ca2+/Na+＞ K+/Na+≈ Mg2+/Na+，在 加 钙 的S3C1 处 理 下K+/Na+≈ Ca2+/Na+＞ Mg2+/Na+。该试验结果表明，外源钙对盐胁迫下K+、Ca2+的平衡调节作用大于Mg2+。

表2 S3C1 和S3C0 处理下木麻黄幼苗根系微区离子比Tab.2 Ion ratio in root micro-region of Casuarina equisetifolia seedlings under S3C0 and S3C1 treatments

2.2.2 叶片Ca2+亚细胞化学定位的变化 钙离子作为第二信使，参与植物生长发育中的各种生理代谢过程。由图2 中S3C0 和S3C1 两种处理下幼苗叶片Ca2+亚细胞化学定位来看，在钙抑制剂EGTA 作用下，并未观察到明显的Ca2+定位（图2a），说明试验结果是可靠。在S3C0 处理下除液泡膜上有少量Ca2+定位外（图2b），未发现其他部位有明显Ca2+定位，而在S3C1 处理下在液泡、质膜上发现了大量Ca2+定位（图2c）。这说明，盐胁迫下加钙后引起木麻黄幼苗叶片膜系统中Ca2+增加。

图2 S3C0 和S3C1 处理下木麻黄幼苗叶片Ca2+亚细胞化学定位Fig.2 Ca2+ cytochemical localization in leaves of Casuarina equisetifolia seedlings under S3C1 and S3C0 treatments

2.2.3 叶片质膜透性的变化 叶片质膜透性直接反映膜系统受损伤程度。从图3 可以看出，与未加钙S3C0 处理相比，在加钙S3C1 处理下叶片相对电导率和MDA 含量显著降低，分别较S3C0 处理降低了43.0%和23.8%。这说明，加钙后叶片质膜透性减小，膜系统损害程度减轻。

图3 S3C0 和S3C1 处理下木麻黄幼苗叶片相对电导率和MDA 含量变化Fig.3 Changes in relative conductivity and MDA content in leaves of Casuarina equisetifolia seedlings under S3C1 and S3C0 treatments

3 结论与讨论

木麻黄由于其耐盐抗旱能力强，在我国沿海地区被作为防护用材林树种广泛种植[5,9]。然而大量研究证明，早期木麻黄盐敏感性较强，在盐渍环境中易遭受损伤，从而抑制了植株生长发育，造林成效不高[7-8]。从以往有关外源钙对植物盐害缓解研究报道来看，认为外源钙能有效减轻植株盐害率[14]，这与本研究结果是相似的。笔者发现，供试木麻黄幼苗在盐害阈值120 mmol·L-1NaCl 范围内，高浓度外源钙30 mmol·L-1CaCl2降低了幼苗存活率、增加了植株盐害率，而在160 mmol·L-1NaCl 处理下，施加30 mmol·L-1CaCl2反而增加了幼苗存活率、降低植株盐害率。这表明，外源钙能有效缓解木麻黄幼苗的盐害程度，但具体使用浓度需依据盐浓度进行调整，具有“低盐低钙、高盐高钙”趋势。

植物遭受的盐害主要来源于单盐离子，即Na+和Cl-毒害[23]。从施钙前后木麻黄幼苗根系微区Na+、Cl-相对含量的变化来看，二者在施钙后均有所下降，但Cl-仍保持在一个较高水平，尤其中柱中Cl-相对含量高达38.1%，说明外源CaCl2使用未能有效对盐胁迫下苗木根系中Cl-进行区室化，Cl-损伤未得到明显减轻，这可能也是在本试验中，除对照外各处理幼苗存活率虽得到大幅提升，但苗高、地径、生物量增量不明显的原因。Ca(NO3)2是生产中最为广泛使用的一种钙肥。但氮素作为植物生长发育中的一种重要营养元素，具有促进植物生长，提升抗逆性的作用。本试验为明确钙对盐胁迫的缓解效果，因此使用了CaCl2来代替Ca(NO3)2。考虑到Cl-毒害性，今后为进一步提升外源钙对木麻黄幼苗盐害的缓解作用，建议可采用Ca(NO3)2作为沿海地区木麻黄幼林生长期的钙肥进行施用，从而达到增强木麻黄耐盐性，提高育林成效的目的。

研究证实，过量Na+导致植物体内离子失衡，从而造成营养元素亏缺，生理代谢活动紊乱，细胞膜透性增加[24-25]。本试验通过分析120 mmol·L-1NaCl+0 mmol·L-1CaCl2（S3C0）和120 mmol·L-1NaCl+30 mmol·L-1CaCl2（S3C1）处 理下根系微区中Na+、K+、Ca2+、Mg2+相对含量发现，盐胁迫下Na+大幅增加，K+、Ca2+、Mg2+减少，施钙后Na+含量明显下降，K+、Ca2+、Mg2+含量增加。从K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+大小来看，K+/Na+、Ca2+/Na+明显大于Mg2+/Na+。结合叶片Ca2+亚细胞定位和质膜透性观测结果可知，施钙后膜系统上Ca2+定位明显增多、膜透性减小，说明盐胁迫下施加外源钙能有效增强膜系统完整性。K+具有与Na+相似的离子半径与水合能，盐胁迫会使植株体内Na+富积，从而导致K+吸收困难，对生长造成不利影响[26-27]。Ca2+在保持细胞膜完整性和稳定性方面发挥着重要作用[28]。维持稳定的Ca2+水平，一方面能增加膜系统完整性，同时作为第二信使，能保持正常的生理功能，增强对营养元素吸收[29-30]。笔者认为，盐胁迫下使用外源钙能增强膜系统稳定性，增强植株对K+吸收利用。这反映了，外源钙对盐胁迫下木麻黄幼苗盐害缓解作用的核心机制一是保护膜系统完整性，二是调节K+平衡。因此推测，为有效提升木麻黄的耐盐能力可适当施用钙钾含量较高的混复肥，既能增强膜系统完整性，同时增加植株K+含量，促进植株生长发育。