黄芪甲苷提取与纯化工艺的研究进展

李燕中，李 强，邬学清，吴亚丽，金 宏，刘拴成

(1.集宁师范学院 化学与化工学院；2.集宁师范学院 生命科学与技术学院，内蒙古 乌兰察布 012000)

黄芪为豆科多年生药用草本植物，是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，作为天然中草药，又名绵芪、绵黄芪，有“补药之长”的美称[1,2]。《中国药典》中记载黄芪包括蒙古黄芪和膜荚黄芪两种，蒙古黄芪主要分布在我国的内蒙古、河北、山西等地；膜荚黄芪分布于吉林、辽宁、黑龙江、河北、内蒙古、山西、陕西和甘肃等地。其药性温和、味甘，有补气升阳、止汗固表、利水消肿、排脓托毒、行滞通痹等临床功效，可用于气虚乏力、中气下陷、表虚自汗、气虚水肿、血虚萎黄等的治疗[1]。黄芪作为一种免疫促进剂或免疫调节剂在人医临床已广泛应用，同时黄芪作为饲料添加剂还能够改善动物生长性能，增强多种动物的免疫功能[3]，并且黄芪还可作为外源性抗氧化剂，提高机体抗氧化能力，改善肉质和风味，延缓酸败程度[4,5]。

黄芪的化学成分众多，主要含有多糖类、皂苷类、黄酮类及氨基酸类等。黄芪甲苷是黄芪中的主要活性成分之一，是目前评价黄芪质量及黄芪制剂质量的重要指标性成分[6,7]。黄芪甲苷具有增强免疫功能、抗炎、降压、稳定红细胞膜、提高血浆环磷酸腺苷(cAMP)含量和促进小鼠再生肝DNA合成等多种作用[8,9]。

1 黄芪甲苷提取方法和工艺现状及存在的问题

中药提取有着久远的历史，煎煮法、冷浸渍法、回流法、索氏提取法等都是传统的提取分离手段[10]。目前，黄芪甲苷提取方法常采用浸泡提取法、索氏提取器提取法、超临界流体萃取法和发酵法[11，12]，纯化方法常用大孔树脂吸附法和碱化处理法。虽然也有研究人员提出超声提取法、微波辅助萃取法、超高压提取法、加速溶剂萃取法等，但实际生产中应用较少。

判断黄芪甲苷提取工艺是否优良可以考虑以下几个因素：①黄芪甲苷得率的高低；②整个工艺流程是否经济；③黄芪甲苷的活性。常规提取工艺往往存在提取效率低、提取时间长、杂质含量大、溶剂消耗大、操作流程复杂等缺点，阻碍了黄芪甲苷的研究与开发。因此，笔者总结了近年有关黄芪甲苷提取工艺的研究，以便为后续黄芪甲苷的研究开发提供依据。

2 黄芪甲苷提取方法和工艺的研究进展

近年来，有不少关于黄芪甲苷提取工艺改进与优化的研究报道，常用的提取方法和工艺主要分以下几类。

2.1 热提法

热提法主要包括煎煮法、回流提取法以及连续提取法，是一种传统提取方法，一直沿用至今。研究人员在使用热提法过程中不断优化黄芪甲苷的热提条件。一些研究人员对黄芪甲苷提取工艺进行了正交实验的研究[13-16]，其中，昝丽霞选取了黄芪甲苷含量、干膏收率、总黄酮含量指标，考察了影响黄芪中有效成分提取的因素，结果显示，乙醇浓度为70%时，在70℃下，以1∶12的料液比提取3 h，测得干膏有25%左右得率，黄芪甲苷含量超过3%[13]。在该工艺条件下，优选出的黄芪乙醇提取工艺相对科学、经济，能有效节约资源，可进一步开展用于工业生产的研究。

马雪松等对比了回流提取法与煎煮法，选取指标为黄芪甲苷得率，考查了提取方法和影响因素。结果表明，药材充分粉碎后，经8 h预浸泡，pH值均对煎煮法和回流提取法产生了主要影响，在pH值为12时，煎煮法在60℃下首次煎煮1 h是最佳提取条件，而回流提取法所用乙醇用量为药材质量的6倍，乙醇体积分数为60%时提取效果最好[14]。

黄际薇以黄芪甲苷含量为指标进行正交试验，考察了药材粒径、浸泡时间和提取次数的影响因素，筛选出黄芪甲苷提取最佳工艺条件是过40目筛的药材经浸泡时间6 h，3次提取[16]。

张素清等采用醇提法，以黄芪甲苷提取量为指标，通过正交试验分析与R语言结合BP神经网络及遗传算法，优化了黄芪中有效成分黄芪甲苷的提取工艺。结果表明R语言结合BP神经网络模型具有良好的预测性，为优化中药材提取及相关制剂工艺提出了一种新的优化方法[17]。

2.2 超临界流体萃取法

宋振民等以黄芪甲苷的含量为指标，采用正交试验法，优化了肺痿颗粒中黄芪甲苷的超临界CO2萃取最佳工艺。结果显示该优选工艺有效成分提取率高，最佳提取工艺是利用95%乙醇夹带剂浓度，粉碎粒度40目、提取时间1.5 h、采用10 mL·min-1夹带剂流速进行超临界萃取[18]。

纪莎等用正交试验优化了黄芪中黄芪甲苷超临界CO2萃取法提取工艺[19]，以黄芪甲苷得率为考察指标，用超临界CO2萃取法提取黄芪甲苷，考察了萃取压力、温度、时间、萃取剂流速这几种影响因素。结果表明，超临界CO2萃取法提取黄芪甲苷的最佳工艺条件是:在45 ℃萃取温度、45 MPa萃取压力、萃取剂流速选择20 L·h-1，经过2 h萃取。

2.3 发酵法

随着中药发酵技术的不断开展，大量学者运用发酵技术以实现中药有效成分的释放，这不仅能提高中药有效成分的释放量，还可通过微生物对中药的纤维、糖类、蛋白质等成分进行利用和转化，产生包含多种活性成分的制剂或新药[20]。中药发酵借助于酶和微生物的作用，在一定的环境条件下(如温度、湿度、空气、水分等)，使药物通过发酵过程，改变其原有性能，增强或产生新的功效。

侯美如等利用紫外分光光度法，测定了水浸法、水煎法两种提取方法对黄芪与发酵黄芪中总皂苷的提取量[21]。研究结果表明发酵黄芪经水浸法、水煎法提取的总皂苷量显著高于对照黄芪的提取量，可能是皂苷热稳定性较差，经长时间高温处理使皂苷受损，从而导致含量下降。同时发现黄芪经产纤维素酶解淀粉芽孢杆菌发酵后，降解了中草药细胞壁的组成成分，如木质素和纤维素等，使得包裹在细胞壁内活性成分能够释放，进而提高黄芪总皂苷的含量。中药发酵不再需要化学提取剂，因而工艺简单、成本低，也是优势之一。

3 常用黄芪甲苷纯化方法探讨

热提产物通常用萃取来进行纯化，然而萃取法所用溶剂耗费量大，富集效果差。为此不少研究者进行了纯化方法的探讨。其中使用多、效果相对较好的有大孔吸附树脂纯化法和碱化处理法。

3.1 大孔吸附树脂纯化法

有研究表明，通过大孔吸附树脂处理，可以提高黄芪甲苷的纯度。蒋思德等利用3种树脂对黄芪皂苷进行了吸附和解吸实验[22]，发现最适合黄芪皂苷纯化的是D101树脂，最佳条件下黄芪甲苷能达到93.21%的转移率。而冯俊选择75%乙醇作为醇提试剂，之后利用大孔树脂吸附法纯化黄芪皂苷，也发现D101树脂由于解析率高，适合黄芪提纯皂苷。

葛慷艳等利用甲醇回流提取黄芪甲苷，水溶液用水饱和的正丁醇萃取，合并正丁醇液后用氨试液洗涤，之后用丁醇饱和的水萃取，比较了高效液相色谱—紫外检测法与CAMG薄层扫描法对黄芪甲苷含量的测定[23]。由于前者仅在200 nm处有弱的末端吸收，噪音对结果影响较大，结果重现性差。而薄层扫描法重现性好，不受紫外下无吸收成分的影响，相对来说是较好的一种黄芪甲苷含量测定方法。同时对样品制备方法进行了改进，对照使用D101大孔树脂进行分离，发现不用树脂进行分离时，黄芪甲苷含量要高出10%左右，使用大孔树脂进行分离可能会导致一部分黄芪甲苷损失。

章诗迪对大孔树脂洗脱梯度进行优化实验时，发现用大孔树脂富集黄芪甲苷时，最佳洗脱条件为纯水、30%乙醇水溶液依次除杂，并用70%乙醇水溶液富集[24]。

3.2 碱化处理法

杨晓雷等研究了从黄芪生药中提取黄芪甲苷的新工艺[25]，采用黄芪生药和提取液比为1∶12的5% NaOH溶液加热回流提取，经HPD300大孔树脂柱去除杂质，再用正丁醇萃取，黄芪甲苷得率高于传统工艺，操作简单，纯度较高。

杨长花等发现黄芪药材产地、质量不同，测定黄芪甲苷含量，各不相同。总体来看，碱化处理后黄芪甲苷含量明显高于未用碱处理的[26]。她们比较了4个主要黄芪产地黄芪质量，利用冷浸法测定水溶性浸出物和醇溶性浸出物，应用高效液相色谱法测定黄芪甲苷的含量，结果表明，4个主要黄芪产地黄芪的水溶性浸出物含量均比醇溶性浸出物含量高。其中黄芪甲苷含量测定结果显示，内蒙古出产的黄芪质量最为优质，其次是甘肃、山西和黑龙江出产的黄芪。

也有研究人员对黄芪甲苷提取时减少杂质的干扰进行了研究。韩凤波发现用NaOH调节pH至11，经过75%碱性乙醇碱化处理后，能促进黄芪皂苷向黄芪甲苷转化[27]。用甲醇洗涤进行黄芪甲苷纯化，工艺简单，减小了黄酮类、蛋白质、多糖等杂质对于黄芪甲苷制备的干扰。

由于黄芪甲苷为水溶性物质，在黄芪复方制剂中黄芪甲苷易与组分中其他成分极性近似、理化性质相近的水溶性成分互相干扰，不易进行质量控制。而不少含黄芪新药的质量标准[1,28]中，柱层析分离纯化样品仍需要在采用索氏提取、正丁醇萃取等操作后使用，导致操作繁复，无法对一些复杂的复方制剂进行分离测定。为解决该问题，张玲等人采用甲醇回流，再用水饱和正丁醇提取黄芪甲苷，而正丁醇提取液用碱洗后经水洗到中性以便除去杂质[29]。采用双波长薄层扫描法，分析了5种以黄芪为主药的中成药中黄芪甲苷的含量，该提取方法不需要上柱分离，就能有效除去杂质，方法简便快捷，具有比较好的准确度和精密度，适用于黄芪制剂的质量控制。

夏广萍等进一步利用不同处理方法对黄芪甲苷含量影响进行了实验[30]，结果发现，采用氢氧化钠溶液处理的大孔吸附树脂法，其结果与药典法中索氏提取法所测的含量之间无明显差异，而使用氢氧化钾甲醇溶液皂化，经加热回流处理后的黄芪甲苷含量最高，与前面两种方法相比，测量结果差异较大。

张金红等采用正交实验，利用碱水解法显著提高了黄芪中黄芪甲苷收率[31]。以黄芪甲苷的收率为考察指标,优选黄芪甲苷的提取工艺。发现对黄芪甲苷的收率起主要作用的是NaOH溶液浓度,最佳工艺条件为选用0.100 mol·L-1NaOH溶液,室温水解2 h,黄芪与碱溶液料液比为1∶12,结果显示，经碱水解法的黄芪甲苷含量大约是未经碱处理对照组的16.4倍。该方法简便易行,为工业化生产提供了依据。

章诗迪对提取液pH条件进行了优化，发现虽然pH值为13时提取出的黄芪甲苷含量最高，但由于配制碱液所用氢氧化钠为杂质，在工业生产中尽可能除去，而pH为12时的黄芪甲苷纯度与pH为13的结果接近，为节约除杂成本，生产中建议采用pH值为12[24]。

4 小结

目前黄芪甲苷传统提取方法存在的问题是黄芪甲苷得率低、缺少优化工艺导致黄芪甲苷纯度低、得率偏低，可以采取提取后再进一步纯化的方法提高黄芪甲苷的纯度。也有的提取过程繁杂、药材浪费多，而且黄酮、多糖等成分对于黄芪甲苷提取有一定的影响，可以采用碱化处理后，用甲醇洗涤进行黄芪甲苷纯化，减小黄酮类、蛋白质、多糖等杂质对于黄芪甲苷制备的干扰。正丁醇萃取处理可以提高纯度，但是正丁醇沸点高，溶剂回收难。可以采用甲醇回流，再用水饱和正丁醇提取黄芪甲苷，而正丁醇提取液用碱洗后经水洗到中性以便除去杂质。虽然超临界流体萃取提取率比一般提取方法高，但是因为其仪器设备本身造价高，使用、维护费用也较高，实现工业化生产还需进一步提升工艺方法。黄芪发酵无须化学提取剂，工艺简单，成本低，有的研究试验采用解淀粉芽孢杆菌作为发酵菌种，安全性较好。总体来说，应根据黄芪种类及其有效活性成分性质的不同，选择合适的提取工艺来提高黄芪甲苷含量。