基于网络药理学探讨补中益气汤治疗气虚发热证的机制

刘进娜

气虚是由于气的推动、温煦、防御、固摄和气化作用减退引起的一系列病理变化，可伴随多种病证的发生[1]。气虚发热多因饮食失节或劳倦过度、或久病耗伤等损伤脾气伴有发热症的一种病证，常又谓之“脾虚发热证”。脾虚发热证临床主要表现为发热、少气懒言、倦怠乏力、面色萎黄、腹胀纳呆、形瘦、大便溏薄、舌淡苔白、脉缓弱等。围绕“气虚发热”的发热机制，历代医家各执己见，众说纷纭。其中较有代表性的论点有龚廷贤、柯琴的“脾胃虚弱、阴血不足”说；蒲辅周的“虚阳外越”致热说；赵献可、张介宾认的“虚人外感”说[2]。李东垣《内外伤辨惑论》认为气虚发热是因脾虚不能升清，水谷精微等清气反下流成湿，致湿气闭塞下焦，郁久而化热，即所谓“阴火上冲”说。从临床实际来看，并非所有的脾虚患者都出现发热，而脾虚发热多见以脾胃气虚日久或气虚较重，不少患者同时伴有易感或劳累后易发热等特点[3]，提示该证的病机中存在气虚卫外无能及“虚邪郁表”的病理。中医药治疗发热有较好效果，对于一些癌性发热、术后发热或不明原因发热尤具优势。脾/气虚发热除了有体温升高体征外，还伴有免疫力低下、能量代谢障碍和肠道内分泌紊乱等表现[4]，大量临床研究表明，基于中医脾/气虚发热及“甘温除热”治法理论，辨证运用补中益气汤治疗多种非感染性发热(如骨折、术后、产后、肿瘤晚期及艾滋病等)均有良好疗效[5]。网络药理学是将计算机技术与生物学协同应用的新兴学科，目前在中医方面广泛应用其进行复方的相关药理学的研究[6,7]。本研究将运用网络药理学和生物信息学的方法，通过构建中药复方调控网络来预测补中益气汤防治气虚发热证的潜在靶标和作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用TCMSP中药系统药理学数据库分析平台(http://www.snedu.gov.cn/)以补中益气汤的8味中药为关键词分别进行其有效化学成分和作用靶标搜索，在进行有效化学成分检索时以每一活性分子的药物相似性(DL)>0.18、口服生物利用度(OB)>30% 及半衰期(HL)>4 h作为筛选标准。

1.2 收集发热疾病靶点 对气虚发热证进行靶基因搜索时，从genecard基因信息平台(https://www.genecards.org/)以关键词“fever”进行疾病相关的已知靶基因信息检索，并对检索到的靶基因以其评分大于中位数进行筛选；将筛选后的靶基因和补中益气汤的有效成分作用的靶点对比分析，筛选出其交集基因。

1.3 筛选核心靶点与PPI建立 利用String数据库(https://string-db.org)进行成分与疾病的交集基因分析，并制作PPI图。蛋白节点的连线越多、越粗，表明和其他蛋白关联度越大，更有可能成为核心靶点。

1.4 成分-靶点-通路网络的构建 采用Cytoscape(版本3.7.2)构建成分-靶点-通路网络图，并对其进行可视化分析；分析各成分对应通路和相应degree值，确定补中益气汤治疗气虚发热证的作用主要药效成分。根据拓扑参数进行有效作用靶点的筛选，即中介中心性、接近中心性及点度中心性。

1.5 靶点的GO和KEGG富集分析 使用DAVIA数据库完成GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1 补中益气汤组成中药的主要化学成分 使用TCMSP数据库进行补中益气汤组成重要的有效化学成分搜索，共筛选出有效化学成分153个，其中黄芪有16个，人参有20个，甘草有74个，陈皮有5个，升麻有17个，柴胡有14个，将全部有效化学成分使用TCMSP数据库进行作用靶点的搜索，共得到2 600个，进行去重后共获得256个相关靶点。见图1，表1。

图1 补中益气汤主要有效成分-靶点图

表1 作用于靶基因数目最多的10个有效化学成分

2.2 发热的相关靶点 使用genecard数据库使用发热为关键词进行疾病的相关靶点搜索，并进行筛选后共获得1 501个和发热有关疾病靶基因，利用Cytocape建立发热相关靶点相互关系网络。将补中益气汤的主要有效化学成分和疾病相关靶点进行交集筛选，最终得到105个可能和补中益气汤治疗气虚发热证的相关靶点。见图2。

图2 补中益气汤主要有效化学成分与疾病相关靶点交集

2.3 筛选核心靶点 利用String数据库获取补中益气汤气虚发热靶点的蛋白相互作用网络，其存在105个靶蛋白节点，共有2 009条相互作用连线，平均度值为38.3,排名前五的是TNF、IL6、AKT1、JUN、VEGFA。见图3。

图3 交集靶点蛋白-蛋白之间相互作用网络

2.4 补中益气汤有效成分-发热靶点-通路网络的构建 采用Cytoscape3.7.2软件构建补中益气汤中药-有效成分-疾病靶点网络图，共有266个节点(分别是8个中药节点，153个化学成分节点，105个疾病靶点节点)和2 008条边。见图4。

图4 补中益气汤中药-活性成分-靶点网络

2.5 补中益气汤GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 将105个发热疾病相关靶点输入DAVIA数据库完成GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。最终得到GO功能富集分析条目计689个具有明显意义(P<0.05)，生物进程包括：RB1,TOP2A,IL1A,SERPINE1,ADRB2,TNF,RELA,EGFR,PPP3CA,MYC,TGFB1,E2F1,AKT1,MAPK3,IL10,JUN,IL2, STAT1,IL1B,STAT3,FOS,IL4,NFKBIA, CXCL10,VEGFA,AR,IL6,IFNG,IRF1,MAPK14,PGR,PPARA,MET,TP53,NFE2L2；细胞成分：CRP,CXCL8,GSTP1,PON1,SERPINE1,PLAT,MPO,TNF,CXCL2,EGFR,ICAM1,THBD,ERBB3,SPP1,CCL2,HMOX1,LBP,CD14,TIMP1,IL10,TGFB1,ADIPOQ,VCAM1,EGF,MMP3,IGF2,SELE,MMP9,F3,IL2,SOD1,VEGFA,IL4,COL1A1,IL1A,CXCL10,COL3A1,IL6,CD40LG,IFNG,SLPI,IL1B,CAT；分子功能：TOP2A,PTEN,CYP3A4,PTGS2,EGFR,PPP3CA,CCND1,AKT1,HMOX1,SCN5A,JUN,TGFB1,GSTM1,UGT1A1,HSPA5,STAT1,CAV1,MAPK14,NFKBIA,AR,SLPI,CYP1A2,CAT,PGR,TP53。KEGG通路富集分析结果得到118个有明显意义的条目(P<0.05)。见图5、6。

图5 补中益气汤发热作用靶点的GO功能富集分析

图6 补中益气汤KEGG通路富集分析

3 讨论

发热是许多疾病急性期反应中的重要症状之一，主要由炎性反应引发体温调节中枢紊乱而产生，通常分为感染性发热和非感染性发热[8]。在感染性疾病中，发热通常属于体内抵抗感染机制，有利于提高机体抵抗力、缩短疾病时间、降低传染性。非感染性发热常涉及肿瘤、自身免疫、血液等多种疾病[9]，临床持续性发热会导致身体明显不适、消耗体能从而给患者的康复带来很大不利，并且还可能成为疾病发展恶化的重要环节[10]。目前对于非感染性发热，特别是不明原因发热的有效处理仍是临床面临的难题。

现代研究认为,发热一般是由于外源性致热原进入机体,作用于巨噬细胞、淋巴细胞、单核细胞等免疫活性细胞,产生内源性致热原,即大量致热性细胞因子，直接或通过中枢介质间接作用于体温调节中枢，使体温调定点上移，产热增加，散热减少，体温在一个新的调定点达到平衡[11]。目前认为,致热性细胞因子主要包括IL-1、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素(INF)。这些致热细胞因子之间相互调节，最后识别靶细胞受体，尤其是视前叶-前下丘脑区(preoptic anterior hypothalamus,PO/AH)的神经细胞，受体介导活化磷脂酶A,并以花生四烯酸为底物激活环氧化酶(COX)通路，或直接使环氧化酶表达和花生四烯酸代谢增加，产生前列腺素(PGE)，PGE可通过血脑屏障进入下丘脑，影响体温调节中枢神经元[12]。

《内外伤辨惑论》云：“脾胃之气下流，使谷气不得升浮，是生长之令不行，则无阳以护其荣卫，不任风寒，乃生寒热，皆脾胃之气不足所致也”，李东垣创制补中益气汤主治脾胃气虚及气虚发热证。之后明代医家薛己在论述补中益气汤适应证时谓之“治元气不足，四肢倦怠，口干发热，饮食无味，或饮食失节，或劳倦身热”。张景岳也指出“凡因辛苦劳倦而病者，多有患头痛发热恶寒，或微渴，或无汗，或自汗，脉虽浮大而无力，宜补中益气汤”。该方中重用黄芪，补中益气，固表止汗，为君药。人参、白术助黄芪补中健脾，合为臣药。当归和营养血，陈皮理气行滞，为佐药；更用少量轻清升散的柴胡、升麻，协助益气之品升提下陷之中气，与炙甘草合为佐使药。该方作为主治“脾胃虚弱,气虚发热”的要方不仅为历代医家经验传承，也被现代临床运用[13]所印证。

本文利用网络药理学分析了补中益气汤中的8味中药的有效成分及其靶点并完成中药-化学成分-疾病靶点网络的构建。实验发现，山柰酚可以同时抑制白三烯 B4、TNF-α的释放; Formononetin在抗炎、抗氧化应激、神经组织修复等过程中起重要作用,尤其是可促进Nrf2/HO-1通路激活，抑制氧化应激反应，保护脑部组织[14]；licochalcone a能有效的抑制TNF-α诱导的炎性因子的表达，并通过促进 MAPK 通路相关蛋白磷酸化的表达继而抑制炎性因子IL-1β的表达[15]。

对核心靶点的PPI网络进行拓扑分析显示，TNF、AKT1、IL-6是网络中的核心节点。TNF即肿瘤坏死因子，是一种可以引起细胞凋亡的细胞因子，有研究表明TNF-α作为炎性因子，它能促进其他多种细胞因子的产生和释放，最终形成细胞因子网络而扩大炎性连锁反应，可以引起感染及自身免疫性疾病患者出现发热症状；此外，亦有研究表明TNF-α还可刺激下丘脑前列腺素E2产生，从而调节体温[16]。IL-6主要由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生的一种糖蛋白,参与机体炎性反应和抗感染防御作用,还与自身免疫疾病等有密切相关[17]。AKT1编码的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶以抑制细胞凋亡，而后磷酸化并使凋亡机制的组成部分失活。有研究表明AKT1是PI3K/Akt信号转导通路中最为关键的酶[18]，AKT1可通过调节氧自由基的产生及TNF-α、IL-6、IL-8等促炎细胞因子的产生和释放，参与到炎性、免疫调节、细胞存活、分化、增殖等过程中[19]。

进一步的GO功能富集分析显示补中益气汤治疗气虚发热证与生物过程相关的主要有炎性反应、免疫应答、脂多糖反应等；与分子功能相关的主要有DNA拓扑异构酶IIα、DNA-结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA转录因子结合、核受体的活动等。KEGG通路富集分析显示，补中益气汤有效成分治疗气虚发热证要涉及TNF信号通路、Toll样受体信号通路、NOD-like受体信号通路和HIF-1信号通路等。有实验研究发现，补中益气汤能改善气虚发热大鼠模型的免疫底下状态，并推测补中益气健脾退热作用机制可能与提高免疫分子含量相关[20]。亦有研究表明补中益气汤对气虚发热大鼠模型的胃肠激素、免疫介质、物质代谢等具有良好的防治效用，而且有调节相关介质及中枢发热介质的作用[21,22]，但有关气虚发热及补中益气汤益气退热的机制并不清楚。

综上所述，补中益气汤对气虚发热证的治疗涉及多成分、多靶点、多通路，这也是中医方剂发挥疗效的最重要特色。补中益气汤可通过TNF、AKT1、IL-6等多个核心靶点及TNF信号通路、Toll样受体信号通路、NOD-like受体信号通路和HIF-1信号通路等多通路来防治气虚发热。