骨关节炎的基因治疗研究进展

许 航 孟 林

·综述与进展·

骨关节炎的基因治疗研究进展

许 航1孟 林2

1.广西中医药大学附属瑞康医院创伤骨科与手外科，广西南宁 530011; 2.广西骨伤医院关节科，广西南宁 530012

骨关节炎是一种严重影响人们生活质量的骨科疾病，尽管治疗手段较多，但治疗效果仍然欠佳。近几年，随着基因治疗在骨关节炎方面的研究逐步深入，发现其可以通过抑制炎症、抑制软骨细胞凋亡，以及促进软骨细胞增殖等途径发挥重要作用，具有广阔的应用前景。本文结合近年来国内外相关研究文献，对骨关节炎基因治疗的研究现状进行总结分析，为后续相关研究提供参考。

骨关节炎；基因治疗；载体

骨关节炎是一种多见于中老年人及运动员的疾病，临床表现为病变关节疼痛、僵硬、肿胀、功能下降，发作过程为持续性及反复性[1]。近年来，随着分子生物学的飞速发展，基因治疗逐渐成为骨关节炎治疗的热点。骨关节炎的基因治疗是指将具有编码治疗性蛋白的基因导入关节中，使关节组织持续形成具有治疗骨关节炎的蛋白，从而达到治疗骨关节炎的目的。本文广泛查阅近年来国内外有关骨关节炎基因治疗的相关研究，并进行总结分析，旨在为骨关节炎的基因治疗后续相关研究提供参考和借鉴。

1 炎症因子在骨关节炎中的作用

骨关节炎的发病机制尚不完全清楚，目前认为骨关节炎的发病主要涉及致病因素刺激关节组织表达肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（inter-leukin-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎症因子[2]。相关研究表明，TNF-α和IL-1β对于金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和聚蛋白多糖酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin-motifs，ADAMTS）的产生起着重要的调节作用，MMPs和ADAMTS均是降解酶，可诱导软骨降解[3]。在TNF-α、IL-1β等炎症因子的作用下，核转录因子κB（nu-clearfactor κB，NF-κB）被激活，然后引起内皮细胞释放MMPs，通过旁分泌方式来影响软骨细胞功能，最后通过降解软骨的方式来加速骨关节炎的病理进展，也就是说激活NF-κB通路，诱发关节软骨破坏[4]。IL-1β还可促进软骨细胞和滑膜细胞合成并释放前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）产生强大的致痛作用[5]。此外，活化的炎症细胞会产生、累积并释放活性氧，启动氧化应激，进而促进MMPs释放，加速软骨细胞凋亡[6,7]。一般认为TNF-α和IL-1β等炎症因子主要通过调节NF-κB信号通路来影响关节软骨降解。但研究发现，还有许多信号通路与关节炎症相关，提示当阻断NF-κB信号通路时，炎症细胞因子也可通过其他通路释放各种炎性介质诱导软骨破坏[8]。

2 信号通路在骨关节炎中的作用

研究表明，骨关节炎发生、发展中重要的信号通路包括NF-κB信号通路、MAPK信号通路、Notch信号通路、Wnt/β-catenin信号通路等。NF-κB信号通路是重要的炎症通路，可以被多种炎症因子激活，启动炎症级联反应，促使细胞释放大量金属蛋白酶、氧化酶和致痛因子，加速软骨基质的分解及软骨细胞的凋亡[9]。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen- activated protein kinase，MAPK）信号通路在调控软骨细胞的增殖凋亡和炎症方面发挥重要作用，可被细胞炎症因子激活，将细胞外信号传至核内，启动相关基因的表达。Notch信号通路是一条进化高度保守的信号通路，其下游调节基因Hes1可以诱导炎症因子表达，加速软骨降解[10]。但也有研究显示，激活Notch信号通路可使MMPs的表达下调，表明Notch信号通路在骨关节炎发生发展中起重要作用[11]。Wnt/β-catenin信号通路是经典的Wnt信号通路，其中Wnt是一种糖蛋白，可激活下游效应因子β-catenin。Wnt/β-catenin信号通路被激活后可引起软骨细胞损伤，促进骨关节炎的进展。信号通路已成为骨关节炎近年来的热点，坚信随着越来越多因子和通路的作用机制逐步明确。必会给骨关节炎的防治带来革命性的突破。

3 骨关节炎基因治疗相关载体

3.1 腺病毒载体

腺病毒（adenovims）为DNA病毒，它可以感染各时相的细胞，不易与宿主基因发生整和，故被广泛应用于研究。但其缺点是表达时间短、容量小，使用其作为载体可能在体内引起免疫应答，第三代腺病毒载体的产生解决了上述问题。Nixon等[12]采用小鼠和马动物模型，首先体外构建白介素-1受体拮抗剂（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Rα）辅助依赖性腺病毒载体，关节腔注入辅助依赖腺病毒白介素-1受体拮抗剂（helper-dependent adenovirus- interleukin-1 receptor antagonist，HDAd- IL-1Ra）后，组织学检测表明IL-1Ra基因转导后明显减轻了滑膜的炎症，减少了关节软骨的损伤，说明IL-1Ra基因治疗是治疗关节滑膜炎症反应的一种可行的方法。Farrell等[13]体外将携带病毒白介素-10（virus- interleukin-10，vIL-10）靶基因的复制缺乏型腺病毒载体（adenovirus- interleukin-10，AdvIL-10）转染至人间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC），AdvIL-10转染的MSC与脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞共同培养后，ELISA法检测表明巨噬细胞的TNF-α生成下降，说明vIL-10基因转染后可以抑制炎症。

3.2 腺相关病毒载体

腺相关病毒（adeno-associated vires，AAV）是一种DNA病毒，其物理性质稳定，能感染非增殖及增殖细胞，使用腺相关病毒作为基因载体很少在体内引起免疫应答反应，对人不致病，具有较高的安全性。但在实际运用上，AAV可携带目的基因的容量小，感染滴度低，对目的基因的选择有一定限制。Hemphill等[14]体外实验将表达胰岛素样生长因子Ⅰ（insulin-like growth factor Ⅰ，IGF-Ⅰ）基因的自身互补腺相关病毒载体（self-complimentary adeno-associated virus-IGF-Ⅰ，scAAVIGF-Ⅰ）转染马关节软骨细胞，7d后取出标本可以发现IGF-Ⅰ表达提高，同时也明显促进了Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的合成，说明scAAVIGF-Ⅰ具有较强的诱导软骨修复的能力。Watson Levings等[15]实验研究发现，自身互补腺相关病毒载体介导的IL-1Ra转染后，能在马腕关节持续产生IL-1Ra、PGE2浓度明显下降，组织学和影像学显示滑膜炎和软骨损坏得到改善。Rey-Rico等[16]应用组织工程技术，将携带人的TGF-β靶基因的重组腺相关病毒载体（adeno- associated virus-human TGF-β，rAVV-hTGF-β），该聚合物胶束是由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯在水中自组装形成的一种胶体溶液，可以与药物相溶解，增加了药物的代谢稳定性和体内循环时间，也被认为是一种较好的药物输送载体[17]。人骨关节炎软骨细胞与含有rAAV-hTGF-β的聚合物胶束共孵育后，ELISA法测定发现TGF-β表达水平明显比自由载体组高。人软骨缺损培养物与重组腺相关病毒/聚合物胶束共孵育，发现软骨细胞数量明显增加，Ⅱ型胶原蛋白沉积也更多，说明组织工程技术与基因治疗联合应用在提高目的基因的表达、延长目的基因的表达时间、延缓骨关节炎进展方面具有较大优势。

3.3 慢病毒载体

慢病毒（lentivirus，LV）为RNA病毒，其携带的遗传物质为RNA而不是DNA，是以人类免疫缺陷病毒1型为基础发展起来的基因治疗载体，能感染增殖及非增殖细胞，其免疫性小，感染效率高，容纳外源性目的基因片段大，感染滴度高，可长时间稳定表达，是转基因技术的主要载体之一。但不利的是慢病毒可以插入到宿主的基因组中，可能引起宿主基因突变而致瘤[18]。Zhang等[19]应用基因重组技术，将环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）沉默基因、聚集蛋白聚糖酶-1（aggrecanse-1）沉默基因和IGF-Ⅰ的表达基因重组到慢病毒载体中，产生的重组慢病毒感染人骨髓干细胞，7d后RT-PCR检测表明COX-2和aggrecanse-1的mRNA表达明显下降，IGF-Ⅰ的mRNA表达明显上升。在猴交叉韧带切除骨关节炎模型中重组慢病毒感染人骨髓干细胞注射至目标关节，7d后提取关节滑液可以发现IGF-Ⅰ浓度明显升高，炎症因子IL-1和致痛因子PGE2的浓度明显降低，组织学检测也表明COX-2沉默基因、aggrecanse-1沉默基因和IGF-Ⅰ表达基因转导后，避免骨胶原的丢失，促进了关节软骨的合成。Gabner等[20]实验研究证实了慢病毒介导的IL-1Ra基因转染后，可明显降低马软骨细胞的IL-1β、IL-6、MMPs水平，说明IL-1Ra基因治疗是抑制炎症反应的一种有效的方法。

3.4 非病毒载体

由于病毒载体在基因治疗过程中有较多缺点，如免疫原性、致癌作用、基因携带量较有限和病毒载体不能大规模生产等缺点，因此人们开始重视非病毒载体[21]。相比之下，非病毒载体免疫源性低，生物安全性高，基因携带量大，制备简单，易于保存，但低转染效率和转染后基因表达时间短很大程度上限制其广泛使用[22]。目前常用的非病毒载体有阳离子脂质体、阳离子聚合物、化学聚合物、质粒DNA、纳米颗粒等。Jeong等[23]采用一种细胞核靶向聚乙烯亚胺-地塞米松聚合物作为基因递送系统用于骨关节炎治疗的研究，将聚乙烯亚胺-地塞米松聚合物与含有软骨诱导因子性别决定区域Y相关高迁移率组框6（sex-determining region y-related high- mobility-group box 6，SOX6）和性别决定区域Y相关高迁移率组框9（sex-determining region y-related high-mobility-group box 9，SOX9）、血管生成素样蛋白4短发夹RNA（angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4shRNA）的微型环状DNA质粒（mini circle DNA）载体复合形成MC-9/6/shANG。研究表明，递送MC-9/6/shANG至MSC和脂肪干细胞（adipose- derived stem cells，ADSC）后均明显增加了SOX6和SOX9的表达，同时降低了脂肪干细胞ANGPTL4的表达。手术诱导骨关节炎大鼠体内结果显示，MC-9/6/shANG-tADSC转染后的滑液中COX-2和MMP13明显低于MC-9/6-tADSC组。在骨关节炎大鼠模型中关节内注射MC-9/6/shANG可延缓骨关节炎进展。Watkins等[24]通过将负载白介素-10（interleukin- 10，IL-10）基因的DNA质粒注入骨关节炎动物的关节内，能使IL-10在动物体内得到长效表达而产生抗炎效应且没显示明显不良反应，为开展表达IL-10的DNA质粒治疗骨关节炎的临床研究提供了理论基础。Rim等[25]采用大鼠动物模型，首先体外构建分别携带BMP2和TGF-β3的minicircle DNA质粒载体，在体外转导至由人诱导多功能干细胞衍生的MSC中，分别在细胞团块培养基中培养，30d后分别将培养基中的生成的软骨形成颗粒，植入到大鼠股骨髁的软骨缺损中。8周后取出标本后发现，在mcTGF-β3颗粒植入关节中的Ⅱ型胶原蛋白表达最高，mcBMP2颗粒植入关节中的Ⅰ和Ⅹ型胶原蛋白表达最高,均成功地填充了Ⅱ胶原蛋白的缺损区域。且研究还发现，mcBMP2转染率偏低，也就是说虽然mcBMP2转染少量细胞却分泌了较高水平的软骨生长因子。

3.5 非编码RNA

非编码RNA可能会影响骨关节炎的发生和发展，其中包括微小RNA（microRNA，miRNA）、长非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）和小核仁RNA（snoRNA），虽然不编码蛋白质，但仍会影响基因表达。miRNA调节转录后基因的表达，在软骨细胞增殖凋亡、软骨外基质代谢、炎症反应中起重要作用。研究发现，miRNA-27a-3p的上调可能抑制软骨细胞中MAPK和NF-κB信号通路并最终减少ADAMTS-5的生成[26]。骨关节炎的体内外模型显示，miRNA影响关节软骨分解代谢的调节，但并非所有miRNA对骨关节炎均有正性保护作用，研究显示，在人类骨关节炎模型中，miR-138-5p、miR-146a-5p、miR-335-5p和miR-9-5p的表达均明显升高[27]。最近在骨关节炎组织中确定了一种新型的miR-4303靶标Asporin（ASPN）[28]，其通过与各种生长因子结合降低其活性，影响软骨的代谢，最终导致发生骨关节炎[29]，因此，miRNA可作为潜在的辅助诊断标志物，用于追踪骨关节炎的病程，血清miRNA水平可作为骨关节炎早期诊断的敏感标志物，有望成为骨关节炎早期诊断的新靶标。

另一种非编码RNA-lncRNA已成为骨关节炎发病机制的重要调控分子。研究表明，在骨关节炎的软骨细胞中，lncRNA H19表达上调，并下调miR-140-5p表达，从而促进骨关节炎炎症和软骨降解的发展[30]。另有研究显示[31]，高表达的LncRNA MALAT1可通过充当“miRNA分子海绵”降低miR-150-5p有效性，干扰miR-150-5p介导靶基因AKT3下调，进而诱导软骨细胞凋亡。以上结果提示，在骨关节炎中lncRNA的部分促损伤作用可能是通过负向调控miRNA而实现，两者可作为骨关节炎治疗的靶标，非编码RNA参与基因表达，表明其可作为骨关节炎基因治疗的新靶点。

4 骨关节炎基因治疗的临床试验

2017年7月，首个骨关节炎基因治疗产品Invossa在韩国问世[32,33]。目前，Invossa的Ⅲ期临床试验已在美国得以重启。在近期一项Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，4例手骨关节炎患者被导入负载干扰素的AVV载体，其中3例患者不能耐受不良反应而中途退出[34]。另一项Ⅰ期临床试验共纳入9例膝骨关节炎患者，将负载IL-1Ra的AAV载体导入所有的患者后，没有严重的不良反应发生，证明其治疗骨关节炎具有一定的临床可行性和安全性。

5 总结与展望

骨关节炎是严重影响中老年人生活质量的一种退行性疾病，目前临床上还没有用于有效预防及根治骨关节炎的药物。基因治疗可以延缓关节炎症并修复软骨，但仍存在许多未解决的问题。相信随着分子生物学和组织工程学等相关学科的发展，骨关节炎的基因治疗一定会显现出更加光明的应用前景。

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广西壮族自治区青年岐黄学者培养项目（桂中医药科教发[2022]13号）；广西中医药大学一流学科建设开放课题（2019XK026）

孟林，电子信箱：14262618@qq.com

（2022–08–04）

（2022–09–10）

R684

A

1673–9701(2022)36–0112–04