miR-34a与糖尿病肾病肾小管间质纤维化发病机制的研究进展▲

张颢曦 范晓兰 杨 敏

(昆明医科大学第二附属医院肾脏内科，云南省昆明市 650101)

【提要】 糖尿病肾病是糖尿病的主要微血管并发症，而肾小管间质纤维化是糖尿病肾病主要的病理表现。在高糖环境中，miR-34a表达上调，并可通过靶向作用过氧化物酶体增殖物激活受体γ，调控转化生长因子β1、结缔组织生长因子、炎症因子等以发挥其促纤维化作用。miR-34a还可以通过直接调控Klotho蛋白、沉默信息调节因子信号通路等发挥促纤维化作用，从而促进糖尿病肾病的进展。本文就miR-34a在糖尿病肾病肾小管间质纤维化中的作用机制研究进展进行综述。

据统计，20%～40%的糖尿病患者会发展为糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)，DN是糖尿病的主要微血管并发症之一，也是终末期肾病的主要原因[1]。终末期肾病的病理特征是肾小球硬化、血管硬化、肾小管间质纤维化和肾小管萎缩，DN从早期开始就有不同程度的肾小管损伤，表现为肾小管基底膜增厚、肾小管炎性病变、肾小管萎缩、细胞凋亡增加、肾小管间质纤维化和肾小管周围毛细血管变薄[2-3]。肾小管间质纤维化是导致肾衰竭的重要原因，表现为肾小管萎缩和细胞外基质蛋白(如纤连蛋白和胶原蛋白)的积聚，而上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被认为是肾小管间质纤维化发生的主要原因[4]。

miRNA是内源性表达的小非编码核糖核酸，通过与靶基因3′-非翻译区的碱基进行完全或不完全配对来调节靶基因的表达，直接特异性降解和切割靶mRNA或抑制靶mRNA的翻译，对基因表达起到负调节的作用，在细胞生长、分化、增殖和死亡中扮演重要角色[5-7]。研究表明，miR-34a对DN的发生、发展具有重要作用，miR-34a在2型糖尿病和DN患者中过表达，对肾小管间质纤维化具有调节作用[8-9]，但其通过调节肾小管间质纤维化从而影响DN进程的机制尚未完全明确。本文就miR-34a在DN肾小管间质纤维化发生中的作用机制的研究进展进行综述。

1 miR-34a通过调控过氧化物酶体增殖物激活受体缓解肾小管间质纤维化

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)是一种配体依赖性转录因子，目前已知有PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三种亚型[10]。PPARγ主要富集在脂肪组织中，调控脂肪生成和脂质储存过程，但其在许多非脂肪组织中也存在低水平表达的现象，包括肾脏和脉管系统[11]。在肾脏中，PPARγ可在所有类型的肾小球、肾小管和肾小管间质细胞中表达[12]。PPARγ经过翻译后修饰(包括糖基化、磷酸化等)可参与调控多种生物进程，如调节葡萄糖代谢、胰岛素敏感性、脂质代谢、纤维化、炎症和氧化应激等[10，13]。研究表明，在高血糖状态下，近端肾小管细胞中钠-葡萄糖协同转运蛋白(sodium-glucose cotransporter，SGLT)降低，减少了对葡萄糖的摄取，引起葡萄糖转运功能障碍，并促进EMT，导致肾纤维化，而PPARγ激动剂可以恢复功能性SGLT介导的葡萄糖摄取，改善葡萄糖转运功能，逆转高血糖诱导的EMT过程，缓解肾纤维化[14]。PPARγ是miR-34a的直接靶基因，PPARγ的表达水平与miR-34a家族成员的表达水平和活化程度呈负相关[15]。miR-34a在DN患者中呈高表达水平，其不仅与高糖诱导的肾小管损害有关，还能通过直接靶向作用于PPARγ，影响肾小管间质纤维化[16-17]。PPARγ可与多种因子相互作用从而参与DN的肾小管间质纤维化，miR-34a对肾小管间质纤维化的影响或许与通过靶向PPARγ来调控相关因子有关。

1.1 PPARγ与转化生长因子β1 转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)可调节许多细胞行为，包括细胞增殖、分化、黏附和凋亡等[18]。TGF-β1作为一种促进纤维化的重要细胞因子，可抑制上皮表型所必需的基因(如上型钙黏蛋白)的表达，并促进间充质表型所必需基因(如波形蛋白、胶原蛋白-1、N-钙粘蛋白)和侵袭表型所必需的基因(如金属蛋白酶) 的表达[19]。同时，TGF-β1还促进细胞外基质(如纤连蛋白和Ⅳ型胶原)的产生[20]。TGF-β1可通过诱导EMT过程促进肾小管间质纤维化[21]：一方面，TGF-β1可以从受损的上皮细胞转移到肌成纤维细胞，表现为TGF-β1信号通过其细胞膜受体Ⅰ和Ⅱ传导，激活并促其下游信号分子Smad2和Smad3发生磷酸化；磷酸化的Smad2/3与Smad 4(一种常见的Smad伴侣)异聚，形成的复合物转移到细胞核中以调节靶基因的转录[22]；TGF-β1可诱导成纤维细胞中miR-34a表达上调，而miR-34a通过微泡的方式分泌并通过破裂的管状基底膜输送到管状上皮细胞中，在管状上皮细胞中通过p53转录下调抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2的表达，促进管状上皮细胞的凋亡，导致肾小管萎缩，进而导致肾小管间质纤维化[23-24]。另一方面，EMT导致肌成纤维细胞数量显著增加[25]，而肌成纤维细胞是分泌细胞外基质的间充质细胞的主要来源[26]，其可特异性表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，α-SMA会导致细胞外基质过度积聚、肾小球硬化和肾小管间质纤维化，破坏肾脏的正常结构和功能[27]。研究表明，PPARγ激活剂(曲格列酮和罗格列酮)可降低葡萄糖诱导的肾脏TGF-β1高表达，同时还可以逆转EMT过程，降低α-SMA的表达，抑制细胞外基质积聚，从而减轻肾间质纤维化[11，28]。

1.2 PPARγ与结缔组织生长因子 结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是另一种促纤维化细胞因子，与DN的发生密切相关，在DN患者中呈高表达水平[29]。CTGF是TGF-β1诱导纤维化的下游介质之一[30]，CTGF通过血管性血友病因子C型结构域与TGF-β1结合，从而促进TGF-β1与相应受体结合，并通过TGF-β/Smad途径促进细胞外基质蛋白(纤连蛋白和胶原蛋白)表达增加[31]。研究表明，PPARγ激活剂(曲格列酮和罗格列酮)可抑制CTGF基因的表达，从而抑制细胞外基质积聚，减轻肾间质纤维化[32]。

1.3 PPARγ与炎症因子 持续炎症反应引起的肾脏损伤是肾纤维化的起因，高血糖能诱导肾细胞产生各种炎症因子[33]。细胞核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)被认为是糖尿病炎症反应的主要转录因子，能调控巨噬细胞炎症蛋白1、细胞间黏附分子1(intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等下游因子的表达水平。Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)是一种进化上保守的含锌指的转录因子，能调节多种细胞过程，如细胞生长、增殖和分化等[34]。在DN中，NF-κB的激活可促使KLF4与炎症细胞因子的启动子(如IL-6)结合，增加炎症细胞因子的转录，并且KLF4还可与NF-κB的p65亚单位相互作用，激活前炎症细胞因子和触发炎症细胞因子的转录[35]。同时，高糖环境下TGF-β1表达水平增加，TGF-β1通过Smad和p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路直接诱导KLF4磷酸化，磷酸化的KLF4又能与Smad2相互作用，协同激活TGF-β-RI的启动子，降低KLF4的表达水平[36]。研究表明，KLF4可通过抑制TGF-β1诱导的人肾小管细胞中MCP-1的产生来减轻炎症反应和纤维化，M1型巨噬细胞持续激活或M2型巨噬细胞活化不足时，机体内促炎因子大量分泌，形成慢性炎症，MCP-1通过MCP-1/C-C基序趋化因子受体2途径减少促炎(M1)型巨噬细胞的募集及MCP-1的产生，从而减轻炎症反应和纤维化，但对TGF-β1介导的纤连蛋白和胶原蛋白的表达无影响[37-39]。此外，KLF4还可与Smad3直接相互作用，抑制肌成纤维细胞分化，减少细胞外基质的堆积，缓解肾间质纤维化[40]。PPARγ激动剂(吡格列酮)可通过抑制高糖诱导的NF-κB的激活及外周组织炎症细胞因子的释放，促进抗炎(M2)型巨噬细胞转录表达，减轻炎症反应，减少肾小管上皮细胞凋亡，增强胰岛素敏感性；PPARγ激动剂(罗格列酮)还可剂量依赖性地降低晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)诱导ICAM-1的表达来减轻炎症反应，缓解纤维化[11,35]。

2 miR-34a通过调控Klotho蛋白和沉默信息调节因子缓解肾小管间质纤维化

2.1 Klotho蛋白 Klotho蛋白主要在肾小管上皮细胞中表达，最初被称为抗衰老蛋白，降低Klotho蛋白的表达水平可加速肾小管上皮细胞向促纤维化表型转化，并促进成纤维细胞的增殖，而上调Klotho蛋白的表达水平可以通过抑制NF-κB通路相关的炎症细胞因子、趋化因子和生长因子的生成，抑制纤维化，保护肾脏[41]。Klotho蛋白可分为膜型Klotho蛋白和分泌型Klotho蛋白两种形式。分泌型Klotho蛋白可直接与TGF-β受体Ⅱ结合，并抑制TGF-β1与细胞表面受体结合，从而抑制TGF-β1信号，减轻EMT，缓解肾间质纤维化[42]。此外，Klotho蛋白作为钙稳态的调节因子，可能通过抑制足细胞中磷脂酰基醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)依赖性的胞吐作用，抑制瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员6介导的Ca2+内流，从而改善蛋白尿和肾纤维化[43-44]。胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)是胰岛素信号传导的关键调节因子，Klotho蛋白可抑制IRS-1/PI3K/蛋白激酶B信号通路来降低α-SMA、纤连蛋白的表达水平，促进抗氧化因子的表达，减轻肾脏的损伤[44]。研究表明，miR-34a可通过直接结合Klotho蛋白基因中的3′-非翻译区来下调Klotho蛋白的表达水平，并诱导α-SMA和纤连蛋白的表达，抑制上皮型钙黏蛋白的表达，从而促进肾小管纤维化[8]。此外，PPARγ激活剂可通过诱导Klotho蛋白的表达，抑制肾纤维化，减缓慢性肾脏病的进展[45]。但值得注意的是，miR-34a表达水平的异常升高并不是Klotho蛋白表达减少的唯一影响因素。

2.2 沉默信息调节因子 沉默信息调节因子(silent information regulator T1，SIRT1)属于NAD+依赖性脱乙酰酶的高度保守家族，参与许多重要的生物学过程，包括炎症反应、肾间质纤维化、缺氧条件下的自噬、衰老和氧化应激等[46]。研究表明，miR-34a可以通过结合靶基因的3′-非翻译区以转录后抑制SIRT1的表达[47]，而沉默SIRT1可促进其下游分子缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的表达，HIF-1α又可通过低氧应答元件与多种靶基因(如胶原脯氨酰4羟化酶1、胶原脯氨酰4羟化酶2和前胶原赖氨酸)的启动子结合，激活某些EMT调节因子，促进肾纤维化的发展[9,23]。

高血糖不仅可导致活性氧的过量产生、AGEs的形成和AGEs受体的激活，还可促进NF-κB、血管内皮生长因子、TGF-β1的产生，激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，进而诱导各种炎症细胞因子的产生和线粒体活性氧的产生，进一步加重肾脏的氧化应激反应。而SIRT1表达降低时TGF-β1表达显著增加，SIRT1可通过TGF-β 1/Smad信号通路调控成纤维细胞的活化和组织纤维化[18]。此外，SIRT1还被证实在保护细胞免受细胞氧化应激和DNA损伤方面起着重要作用[48]。叉头转录因子O1 (forkhead transcription factor O1，FOXO1)是包含叉头盒的转录因子O家族的成员。SIRT1可通过SIRT1/FOXO1信号通路促进FOXO1自身的表达，增强其转录活性，从而诱导自噬，减少氧自由基对肾脏的损伤，发挥抗氧化能力[46]。此外，过表达的FOXO1通过与启动子直接结合，抑制硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)和促进硫氧还蛋白(thioredoxin protein，TRX)的表达，TXNIP和TRX进一步相互作用以维持氧化应激平衡；SIRT1表达水平升高可通过TXNIP/TRX途径促使FOXO1表达上调，而增加FoxO1的表达水平可降低活性氧水平，减少肾小管细胞凋亡，改善纤维化[49]。还有研究表明，SIRT1和PPARγ辅活化因子1α(PPARγ coactivator-1α，PGC-1α)是线粒体功能的主要调节因子，SIRT1/PGC-1α信号通路是抗氧化损伤的重要内源性通路之一，PGC-1α可被SIRT1激活并参与多种生物学途径，如细胞凋亡、能量代谢、氧化应激等，PGC-1α的高表达可促进参与线粒体DNA转录和线粒体呼吸链调节的多个核编码基因的表达，减少活性氧的合成[50]。PPARγ 激动剂(罗格列酮)可能通过诱导PGC-1α的表达，维持线粒体功能和减少活性氧的产生，从而减轻炎症反应，缓解肾纤维化，同时还可以与改善DN相关的足细胞损伤及肾小球基底膜增厚[51]。

3 小 结

miR-34a在DN肾小管间质纤维化的发生和发展过程中具有重要作用，高糖环境下miR-34a的过表达能够通过抑制PPARγ导致肾小管间质纤维化。miR-34a不仅能通过直接作用于PPARγ激活TGF-β/Smad经典途径引起EMT导致肾间质纤维化，还可通过调控炎症反应、氧化应激等发挥促纤维化作用。此外，miR-34a还可以通过调控Klotho及SIRT1信号通路导致肾小管间质纤维化，但具体机制仍需进一步研究。深入研究miR-34a对肾小管间质纤维化的相关作用机制，有望为DN提供新的治疗靶点。