基于NF-κB/MAPK信号通路miR-125a-5p诱导乳腺癌MCF7细胞自噬的作用机制研究*

郭建美，杨颖博，李 杰

(1.河北省保定市第一中心医院肿瘤内科 071000；2.河北省保定市第一中心医院全科医疗一科 071000；3.河北医科大学第四医院乳腺外科，石家庄 050000)

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，发病率及致死率均较高。近年来，随着生活节奏加快及生活压力提高，发病率逐年升高，且发病年龄呈年轻化趋势，给我国女性健康造成严重影响[1-2]。肿瘤的发生、发展与细胞自噬关系密切，自噬与凋亡共同调控癌细胞的生物学活动。近年来，有研究表明，自噬在乳腺癌进展过程中具有双重调控作用，早期乳腺癌细胞自噬可抑制肿瘤增殖、侵袭或转移[3]。因此，在乳腺癌发病早期寻找有效的手段诱导细胞自噬有助于抑制肿瘤进展。近年来，微小RNA(micro RNA，miRNA)参与调控肿瘤发生、发展已成为研究热点[4]。有研究表明，miR-125a-5p在乳腺癌MCF7细胞系中呈低表达状态，且参与了调控细胞增殖及凋亡过程，但关于其对细胞自噬的调控作用及相关作用机制研究较少见[5]。本研究以人乳腺癌MCF7细胞作为研究对象，建立了miR-125a-5p过表达细胞系，拟观察miR-125a-5p对乳腺癌细胞自噬的诱导作用，并进一步探讨其作用机制，旨在为乳腺癌的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂与仪器

hsa-miR125a-5p模拟物(hsa-miR125a-5p mimics)、对照模拟物(NC-mimics)均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Lipofectamine 2000试剂盒由美国Invitrogen公司生产；单丹磺酰二胺(monodansyl cadaverine，MDC)、Hoechst均由美国Sigma公司生产，兔抗人自噬相关蛋白Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3Ⅱ)多抗及辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G抗体由美国Abcam公司生产，兔抗人核因子-κB (nuclear factor kappa B，NF-κB)p65、磷酸化(phosphorylated，p)-NF-κB p65单抗、鼠抗人有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)p38、p-MAPK p38多抗、鼠抗人细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)、p-ERK1/2多抗均由美国Thermo Fisher公司生产，DMi8型倒置荧光显微镜由德国徕卡公司生产，7500实时荧光定量PCR仪由美国ABI公司生产，PowerPro3AMP电泳仪由英国Cleaver公司生产。

1.1.2细胞株

人乳腺癌MCF7细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，培养于含10%胎牛血清的杜氏改良Eagle培养基培养液，于37 ℃、5%二氧化碳饱和湿度培养箱中培养。

1.2 方法

1.2.1细胞转染

取对数期生长的乳腺癌MCF7细胞，0.25%胰蛋白酶消化后应用重新接种至6孔板，细胞密度为1×104个/孔，分为miR-125a-5p组、miR-NC组和空白组。miR-125a-5p组、miR-NC组按Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书步骤，将hsa-miR125a-5p mimics、NC-mimics分别转染入miR-125a-5p组和miR-NC组，空白组不给予处理。

1.2.2转染效率验证

收集转染48 h后miR-125a-5p组和miR-NC组细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，测定光密度值260/280为1.8～2.0，经琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性后应用逆转录法获得互补链cDNA，并以之为模板进行实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)，按SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书设定反应体系；反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共40个循环，以U6为内参对照、2-ΔΔCT计算miR-125a-5p基因相对表达水平，确认转染效率。引物序列：miR-125a-5p，正向：5′-ACT GAT GAT GCC CAT GCC TG-3′，反向：5′-CTG CTG ATG CTC CTG AAG TG-3′；U6，正向：5′-CTA GCT GAT GCT GAT GCT ACC-3′，反向：5′-CCT GAT GCT GAT CCT GAT CGT-3′。

1.2.3乳腺癌MCF7细胞自噬检测

1.2.3.1MDC及Hoechst双染色观察细胞自噬

将无菌盖玻片放置于6孔板内，以2×104个/mL接种转染后细胞，爬片培养24 h后倾去培养液，甲醇固定15 min，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤2次，加入0.05 mmol/L MDC染液孵育60 min；孵育至45 min时加入10 μg/mL的Hoechst33342染液5 μL，继续同条件孵育60 min；用PBS洗涤2次，封片，于倒置荧光显微镜下观察和拍摄，以核周区域绿色自噬小点大于或等于8个计为阳性细胞，随机选取10个视野。阳性细胞率=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.2.3.2Western blot法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ表达

取稳定转染细胞，计数细胞5×106个，用PBS洗涤，1 500 r/min(离心半径12 cm)离心8 min，取沉淀细胞加入0.3 μL细胞裂解液，冰上孵育60 min，然后于4 ℃预冷离心机上以12 000 r/min(离心半径10 cm)离心15 min，取上清液进行蛋白定量；取待测蛋白样品与Maker同时进样，80～120 V电压下电泳约20 min，然后100 V电压下转膜90 min，将蛋白移至硝酸纤维素膜上，然后用5%脱脂奶粉封闭2 h，然后加入按比例稀释的一抗(1∶1 000)，于4 ℃摇床孵育过夜，洗膜后加入按比例稀释的二抗(1∶8 000)，常温孵育1.5 h，再次洗涤后进行曝光、显影；以Beclin-1、LC3Ⅱ条带灰度值与内参β-actin比值代表蛋白相对表达水平。

1.2.4NF-κB/MAPK信号通路相关基因表达检测

收集转染48 h后细胞，采用RT-qPCR检测NF-κB/MAPK信号通路相关基因表达情况，包括NF-κB p65、ERK1/2、MAPK p38等，检测方法与1.4项相同，以β-actin为内参对照、2-ΔΔCT计算基因相对表达水平。引物序列：NF-κB p65，正向:5′-TCA TGC ATG TCG TAG TCG-3′，反向:5′-ATG CGT GAT GCT GAT GCT-3′；ERK1/2，正向:5′-TAG CTG ATG CGT AGT GCT AC-3′，反向:5′-CCT GTG ATG CTG ATG CCG TA-3′；MAPK p38，正向:5′-TAG CTA CGT GAT GCT GTG A-3′，反向:5′-CTA GTG CTG AAC TGG TCC T-3′；β-actin，正向:5′-CAT GAT GCA TGC TGA TGC TA-3′，反向:5′-AAT GCT GTA GCT ACT GAT CG-3′。

1.2.5NF-κB/MAPK信号通路相关蛋白表达检测

收集转染48 h后细胞，采用Western blot法检测NF-κB/MAPK信号通路相关蛋白表达情况，包括p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-ERK1/2、ERK1/2、p-MAPK p38、MAPK p38等，检测方法与1.2.4项相同，蛋白相对表达水平用待测蛋白条带灰度值与β-actin灰度值比值表示。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 miR-125a-5p基因相对表达水平

空白组、miR-NC组、miR-125a-5p组细胞miR-125a-5p基因相对表达水平分别为0.44±0.08、0.42±0.07、1.27±0.16，组间比较差异有统计学意义(F=95.650，P<0.05)；miR-125a-5p组miR-125a-5p基因相对表达水平高于空白组和miR-NC组，差异有统计学意义(t=10.375、10.883，P<0.05)。

2.2 细胞自噬情况

空白组、miR-NC组、miR-125a-5p组细胞阳性率分别为(2.10±0.52)%、(2.30±0.47)%、(26.40±7.14)%，组间比较差异有统计学意义(F=56.893，P<0.05)；miR-125a-5p组细胞阳性率高于空白组和miR-NC组，差异有统计学意义(t=7.590、7.531，P<0.05)；空白组细胞阳性率与miR-NC组比较，差异无统计学意义(t=0.638，P=0.541)，见图1。

A：空白组；B：miR-NC组；C：miR-125a-5p组。图1 各组细胞自噬情况比较(400×)

2.3 自噬相关蛋白表达情况

3组Beclin1、LC3Ⅱ蛋白相对表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-125a-5p组Beclin1、LC3Ⅱ蛋白相对表达水平高于空白组和miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)；空白组Beclin1、LC3Ⅱ蛋白相对表达水平与miR-NC组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图2。

表1 各组细胞自噬相关蛋白表达情况比较

A：空白组；B：miR-NC组；C：miR-125a-5p组。图2 Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白表达情况

2.4 NF-κB/MAPK信号通路相关基因表达情况

3组NF-κB p65、ERK1/2、MAPK p38 mRNA相对表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组细胞NF-κB/MAPK信号通路相关基因的相对表达水平比较

2.5 NF-κB/MAPK信号通路相关蛋白表达情况

3组p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2、p-MAPK p38/MAPK p38比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；miR-125a-5p组p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2、p-MAPK p38/MAPK p38均明显高于空白组和miR-NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)；空白组p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2、p-MAPK p38/MAPK p38与miR-NC组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3、图3。

表3 各组细胞NF-κB/MAPK信号通路相关蛋白表达情况比较

续表3 各组细胞NF-κB/MAPK信号通路相关蛋白表达情况比较

A：空白组；B：miR-NC组；C：miR-125a-5p组。图3 Western blot法检测各组细胞NF-κB/MAPK信号通路相关蛋白表达情况比较

3 讨 论

自噬是真核细胞自我保护的一种机制，在维持细胞内环境稳定、物质循环再利用等方面具有重要作用[6-7]。目前，自噬已成为研究肿瘤发生机制、抑制肿瘤增殖及化疗耐药的热点。有研究表明，多种抗乳腺癌药物可诱发细胞自噬，且自噬诱导剂可促进肿瘤细胞死亡，且多种自噬相关蛋白或因子在乳腺癌发生、发展中具有重要作用[8]。自噬虽然存在促进和抑制肿瘤的双重作用，但在乳腺癌的治疗中，由于人表皮生长因子受体-2抑制剂的应用而促进自噬的发生，进而增加细胞死亡率[9]。寻找有效促进乳腺癌发展早期细胞自噬的靶点对乳腺癌的治疗具有重要临床意义。

miR-125a-5p属于miR-125家族重要成员，定位于染色体19q13，参与了肿瘤的发生和发展。miR-125a-5p是miR-125a的成熟体，存在双重生物学功能[10]。据文献报道，miR-125a-5p在人肺癌A549细胞中低表达，有助于逆转细胞对顺铂的耐药性[11]。另有研究表明，miR-125a-5p在雌激素受体阳性乳腺癌患者中低表达，过表达后对激素治疗的抵抗作用减弱，敏感性增强[12]；但鲜见文献报道关于其对乳腺癌细胞自噬的影响。本研究采用慢病毒转染法促进乳腺癌MCF7细胞中miR-125a-5p过表达，转染后经MDC及Hoechst双染显示，细胞阳性率高于空白组和miR-NC组，且过表达细胞中自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ蛋白相对表达水平明显升高，提示过表达miR-125a-5p基因可诱导乳腺癌MCF7细胞发生自噬，分析其原因，可能是miR-125a-5p通过与下游某靶基因结合，从而激活或抑制某调控通路，最终导致该通路下游效应分子Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达升高，促进自噬的发生[13]。

此外，本研究结果显示，转染后miR-125a-5p组NF-κB/MAPK信号通路蛋白比值——p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2、p-MAPK p38/MAPK p38均高于空白组和miR-NC组，提示过表达miR-125a-5p基因可能通过激活NF-κB/MAPK信号通路相关蛋白磷酸化水平而促进乳腺癌MCF7细胞自噬。MAPK属于胞外刺激传导蛋白激酶，可通过调节分子亚基磷酸化水平而激活ERK磷酸化级联反应，进一步激活核内NF-κB，从而调控下游相关因子的转录和表达[14-15]。尹昭懿等[16]研究显示，自噬抑制剂3-甲基腺苷可通过调节MAPK信号通路相关蛋白MAPK p38、ERK1/2的磷酸化而促进肝癌HepG2细胞自噬，与本研究结果相似。LEONARDI等[17]研究表明，MAPK及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶均参与了调控乳腺癌细胞自噬过程。本研究结果显示，过表达miR-125a-5p后乳腺癌MCF7细胞自噬作用增强，其可能机制为miR-125a-5p表达上调后使NF-κB/MAPK信号通路激活，该通路中相关蛋白磷酸化随之增强，从而介导癌细胞自噬增强。

综上所述，过表达miR-125a-5p基因可诱导乳腺癌MCF7细胞发生自噬，可能与促进NF-κB/MAPK信号通路相关蛋白磷酸化水平有关，为乳腺癌的临床治疗提供了新的思路；但miR-125a-5p基因能否通过其他通路诱导乳腺癌MCF7细胞发生自噬仍有待进一步研究。