蟾酥乳膏透皮吸收及促进伤口愈合作用的初步研究

李丙旭，王姣姣，马宏跃，周婧

（南京中医药大学，江苏省方剂高技术研究重点实验室/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏省中药药效与安全性重点实验室，江苏 南京 210023）

蟾酥（Bufonis Venenum）之名源于《本草衍义》，属名贵中药，为蟾蜍科动物中华大蟾蜍（Bufo gargarizansCantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostitusSchneider）的干燥分泌物。其性温、味辛，有毒，具有解毒、消肿、止痛、开窍醒神之功效，主要治疗痈疽疔疮、瘰疬、各种疼痛病和神昏吐泻［1］。目前对蟾酥中的蟾毒灵、沙蟾毒精、酯蟾毒配基等甾烯类成分研究较多，大多根据其抗炎、镇痛、抗肿瘤等功效开发产品［2］。但蟾酥在皮肤伤口愈合方面的功效没有明确报道。鉴于此，作者以蟾蜍甾烯为原料药制备蟾酥乳膏，并进行外观及稳定性考察，之后通过体外透皮吸收实验确定蟾酥乳膏剂的体外透皮吸收率。最后将其对皮肤伤口愈合的疗效进行初步研究，为后续的蟾酥产品开发提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1290 Infinity Ⅱ液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；D3024R 低温超高速离心机（美国SCJLOGEX 公司）；BSA124S-CW 电子天平（德国Sartorius公司）；HJ-3恒温磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）；HH 数显恒温水浴锅（常州国宇仪器制造有限公司）；TK-12D 型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；XW-80A 漩涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.2 药品与试剂

蟾毒灵、酯蟾毒配基、沙蟾毒精、蟾毒他灵、华蟾毒它灵、蟾毒它灵（北京普天同创生物技术有限公司，批号分别为：118981、110718、180427、180118、180318、180419）；蟾酥（购买于南京）经南京中医药大学马宏跃教授鉴定为蟾蜍科动物中华大蟾蜍（Bufo gargarizansCantor）的干燥分泌物；蟾酥二氯甲烷提取物（实验室自提）；硬脂醇、白凡士林（上海麦克林生化科技有限公司，批号分别为：O815158、V820408）；十二烷基硫酸钠（上海科雅生物科技有限公司，批号：3250GR500）；丁香油、丙二醇（上海源叶生物科技有限公司，批号分别为：S24039、S24147）；氮酮（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：A104374）；4-羟基苯甲酸甲酯（梯希爱化成工业发展有限公司，批号：H0216）；氯化钠（广东光华科技股份有限公司，批号：7647-14-5，分析纯）；京万红软膏（天津达仁堂京万红药业有限公司，国药准字Z12020440）；甲醇（批号：11074107006，色谱纯）、乙腈（批号：JA092330，色谱纯）（德国Merck公司）。

1.3 动物

豚鼠，雄性，体质量250～300 g，普通级，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，许可证号：SCXK（苏）2017-0011。新西兰大耳白兔，体质量2.0～2.5 kg，普通级，雌雄各半，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，许可证号：SCXK（苏）2016-0008。ICR 小鼠，雌雄各半，体质量20～22 g，SPF 级，购自河南省斯克贝斯生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（豫）2020-0005。豚鼠、兔购入后置于室温20～25 ℃，相对湿度为40%～60%的饲育室内饲养。ICR 小鼠购入后于室温20 ℃，自然光照条件下适应性饲养。

2 实验方法

2.1 乳膏制备

参考前期实验结果，选取十二烷基硫酸钠、三乙醇胺为主要乳化剂［3］，硬脂酸、单甘酯、羊毛脂、硬脂醇和白凡士林为油相。其中硬脂醇还具辅助乳化及稳定作用，白凡士林可在皮肤上形成油膜，防止基质水分蒸发，有利于角质层水合并具润滑作用。选用丁香油用于促进蟾酥提取物的溶解及提高蟾酥提取物透皮吸收率；氮酮为促渗剂［4］；4-羟基苯甲酸甲酯为抑菌剂。

乳膏1 制备方法：硬脂酸10%，单甘酯4%，羊毛脂5%，白凡士林2%，氮酮1%，三乙醇胺1%，抑菌剂0.1%（W/W）。取处方中油相成分在75 ℃条件下不断搅拌至加热熔化，其余成分溶于纯化水加热至75 ℃，为水相。搅拌条件下将水相加至油相，进行充分乳化。待基质乳化完全后，温度降至45 ℃，将丁香油溶解的蟾酥二氯甲烷提取物加入基质中不断搅拌，使分散均匀。

乳膏2 制备方法：油相（硬脂醇和白凡士林）/水相比例为45/55，十二烷基硫酸钠1.5%，丁香油5%，氮酮1%，抑菌剂0.1%（W/W）。制备方法同上。

将制备的乳膏进行外观及稳定性考察。外观考察包括色泽、质地、涂布性等；稳定性考察包括离心稳定性及高温、低温、室温稳定性考察。取乳膏剂样品以4 000 r/min 速度离心30 min，观察是否有破乳和油水分离现象，同时取样于55 ℃、-20 ℃、室温条件下放置24 h，恢复室温后观察是否有破乳和油水分离现象。

2.2 含量测定方法的建立

2.2.1 色谱条件

色谱柱：X-Charge C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：0.2%甲酸-水（A 相），乙腈（B 相）；流速：0.7 mL/min；检测波长：296 nm；柱温30 ℃；进样量：5 μL。梯度洗脱（0～4 min，80%～62% A；4～15 min，62% A；15～25 min，62%～10% A；25～26 min，10%～80%A；26～30 min，80%A）。

2.2.2 对照品溶液的配制

精密称取蟾毒灵、酯蟾毒配基、沙蟾毒精、蟾毒他灵、华蟾毒它灵、蟾毒它灵对照品各10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解、定容，制成质量浓度约为1 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的配制

称取适量乳膏，加入甲醇，密封超声2 h（100 W，50 kHz），离心吸取上清液，用适量甲醇稀释混匀之后过0.22μm滤膜，按照“2.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。

2.2.4 线性关系考察

将混合标准品溶液精确稀释至25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 μg/mL，按照“2.2.1”项下色谱条件测定。以峰面积（A）对浓度（C，μg/mL）作线性回归，得标准曲线线性范围及相关系数，S/N ≥3 作为最低检测限，S/N ≥10作为最低定量限。

2.2.5 精密度试验

取1.25 μg/mL的混合标准品溶液，重复进样6次，按照“2.2.1”项下色谱条件测定。

2.2.6 重复性试验

平行制备1.25 μg/mL 混合标准品溶液6 份，按照“2.2.1”项下色谱条件测定。

2.2.7 稳定性试验取同一供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，按照“2.2.1”项下色谱条件测定。

2.2.8 加样回收率试验

取9 份已知准确含有1.53 μg 甾烯的供试品溶液160 μL，分成3 组，分别加入80、100、120 μL 的混标溶液，制备成含低、中、高3 种浓度混标液的混合溶液。按照“2.2.1”项下色谱条件测定，计算回收率。

2.3 乳膏的透皮吸收率测定方法

将豚鼠麻醉后，用宠物剃毛器及8%硫化钠对豚鼠进行脱毛，用温水擦拭，直至完全脱毛，略擦干后用剪刀剥离豚鼠腹部皮肤，清除皮下血管及组织，用生理盐水冲洗干净。

采用TK-12D 型透皮扩散试验仪，将豚鼠皮肤（有效扩散面积2.54 cm2）固定在接收池上盖与接收池之间，铺平，角质层朝上［5-6］。在豚鼠皮上均匀涂抹适量乳膏，在接收池中注入预热的接收液（生理盐水）。对照组为30%乙醇溶解的等量蟾酥提取物。设置搅拌速度为400 r/min，温度为（37 ± 0.5）℃。2 h 后取出，用40%乙醇和生理盐水将豚鼠皮擦拭干净。剪碎处理豚鼠皮，加入甲醇超声2 h（100 W，50 kHz），过膜后取适量利用超高效液相色谱检测。对皮内6 种甾烯类物质质量（μg）进行加和并与乳膏中各物质质量（μg）之和进行比较，计算透皮吸收率。

2.4 小鼠断尾止血实验

将小鼠随机分成空白组、蟾酥粉组、蟾酥提取物组、乳膏1 组（提取物含量0.5%）和乳膏2 组（提取物含量0.5%），每组8只。将小鼠固定后距尾尖1 cm处用手术剪断尾，至第一滴血自然流出后擦拭干净，开始给药并计时［7］。粉末或乳膏剂以覆盖创口为宜。用滤纸片擦拭创面，无渗血现象出现时记为止血时间，将滤纸片干燥后称重记录出血质量。空白组剪尾后开始计时，不做其他处理。

2.5 家兔皮肤伤口愈合实验

将家兔按完全随机法分为阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（京万红软膏）和蟾酥乳膏2组（0.5%，m/m），每组6只。参照全层皮肤缺损法［8］制备动物体表一般创面模型。3组兔经耳缘静脉注射20%乌拉坦（5 mL/kg）麻醉，脱毛，用酒精消毒后，在背部取2 cm×2 cm的正方形切口，剪开皮肤全层，用碘伏消毒，形成兔全层皮肤缺损开放性创面。次日对无化脓现象的家兔进行给药（0.2 g/只），每日给药1次，连续给药3周。于D0（形成创面的次日）、D7、D14、D21时拍照留存，采用Image J软件对创面面积进行计算，并计算创面愈合率。

2.6 统计学分析

采用SPSS 20.0 统计分析软件进行统计学处理，数据以±s表示，各组间比较采用t检验，以P＜0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 乳膏透皮吸收率结果

制备的2种乳膏色泽均匀，质地细腻，易于涂抹，无粗糙感。离心及室温、高温、低温稳定性良好。透皮吸收率结果如表1所示，表明2种乳膏中甾烯透皮效率与蟾酥溶液相比均有提高。乳膏2 组透皮吸收率略高于乳膏1组。

表1 各组体外透皮吸收率比较（±s，n=3）

表1 各组体外透皮吸收率比较（±s，n=3）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

透皮吸收率（%）4.92±0.83 7.23±0.35*7.95±0.41**组别对照组（蟾酥提取物）乳膏1组乳膏2组皮内甾烯含量（μg）43.99±9.39 58.65±7.68 65.38±6.47乳膏中甾烯含量（μg）890.71±76.09 769.72±56.08 821.21±51.55

3.2 方法学考察结果

沙蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、酯蟾毒配基和华蟾毒精6 种蟾蜍甾烯类化合物的方法学考察结果如表2 所示，结果显示各物质在0.39～50 μg/mL的线性范围内，线性关系良好。精密度、重复性、稳定性考察均良好。6种物质的平均加样回收率均在80%～120%之间，表明该方法具有良好的准确性。

表2 线性关系考察结果

3.3 小鼠断尾止血实验结果

与空白组比较，蟾酥粉、蟾酥提取物及2 种蟾酥乳膏均可明显缩短小鼠出血时间（P＜0.01），降低出血量（P＜0.01）。乳膏2 组与乳膏1 组比较，前者出血时间及出血量均较低，且两组间差异有统计学意义（P＜0.01）。结果表明蟾酥乳膏2是较优配方，详见表3。

表3 各组止血时间及出血量比较（±s，n=8）

表3 各组止血时间及出血量比较（±s，n=8）

注：与空白组相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别空白组蟾酥粉组氯仿部位干粉组乳膏1组乳膏2组出血量（g，n=8）0.091 0±0.010 00 0.001 7±0.000 62**0.001 9±0.000 57**0.008 1±0.000 95**0.004 1±0.001 10**止血时间（min，n=8）123.79±13.26 11.73±2.05**14.37±2.17**49.70±1.85**46.87±1.22**

3.4 家兔皮肤伤口愈合实验结果

结果表明，给药的第7 天阴性对照组伤口愈合率较高，但随时间延长，蟾酥乳膏2 组愈合率逐渐增加。第14、21天时，蟾酥乳膏2组的伤口愈合率与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。在愈合过程中发现，各组家兔基本第3天开始结痂，而涂抹蟾酥乳膏的家兔普遍掉痂较快，掉痂后创面逐渐缩小，且涂抹过程中无红斑、红肿现象出现，表明乳膏2 安全性较好。详见表4。

表4 各组家兔皮肤伤口愈合率比较（±s，n=6，%）

表4 各组家兔皮肤伤口愈合率比较（±s，n=6，%）

注：与阴性对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别阴性对照组蟾酥乳膏2组京万红软膏（阳药）组D7 D14 D21 76.12±6.46 89.54±3.07**84.73±4.65 47.90±9.59 32.51±9.33 31.91±12.15 60.41±13.40 82.92±3.26**59.14±7.73

4 讨论

皮肤伤口愈合涉及4 个阶段，即止血、炎症、增殖和重塑［9］。止血过程主要涉及血小板的黏附、聚集。之后进入早期愈合过程，表现为低炎症水平，这是伤口愈合过程的促进因素。在早期阶段，伤口周围的巨噬细胞被活化成M1 表型，对皮肤表面的病原微生物以及细胞碎片等进行吞噬，同时巨噬细胞以及中性粒细胞分泌促炎介质和趋化因子，以便于下一阶段所需血管内皮细胞、成纤维细胞等的募集及增殖［10-11］。这些细胞募集到伤口处后，在促炎细胞因子IFN-γ、TGF-β 等的调节下，进行血管生成以及再上皮化。在后期愈合过程，巨噬细胞产生TNF-α等细胞因子来诱导中性粒细胞凋亡，之后从M1 促炎表型转换为M2 抗炎表型，释放抗炎因子［12-13］。M2 型巨噬细胞同时释放免疫抑制因子Arg-1 来催化多胺的形成从而促进细胞增殖和胶原沉积，以达到皮肤重塑的目的［14］。

《证治准绳·类方》中写道“治齿缝中血出上以纸纴，蘸干蟾酥少许，于血出处按之，立止”表明了蟾酥外用止血的潜在功效，但蟾酥在整个伤口愈合过程中是否发挥积极作用尚未得到证实。另外，蟾酥以粉末形式使用时的用量不易控制，且有刺激性气味。基于此，作者制备了外观、稳定性及透皮吸收率良好的蟾酥乳膏配方，以期开发出具有促进伤口愈合疗效的安全外用制剂［15］。

家兔皮肤伤口愈合实验结果中蟾酥乳膏在给药一周后表现出促进伤口愈合的效果，其机制可能与抗炎作用有关［16-17］，还有待进一步阐释。另外，涂抹乳膏后未见兔皮肤出现红斑、红肿，显示了蟾酥乳膏具有一定的安全性。但后续还需利用皮肤敏感性较高的动物（兔、豚鼠等）［18-20］进行皮肤刺激性评价以及研究不同剂量的蟾酥乳膏对兔皮肤的刺激性以及对伤口愈合的影响。