玉米醇溶蛋白/乳清蛋白纤维核复合纳米粒稳定Pickering乳液的制备与性质

付思晗，齐玉堂，张维农，贺军波，张燕鹏，吕晓雅

(武汉轻工大学 食品科学与工程学院，武汉430023)

玉米醇溶蛋白是玉米蛋白中的主要成分，因其氨基酸组成主要是疏水性氨基酸，如谷氨酰胺、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸，而极性、带电的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量则很少，所以其具有特殊的溶解性，即在纯水中的溶解度非常低[1]，而溶于乙醇溶液。玉米醇溶蛋白特殊的溶解性阻碍了其在食品行业的应用。因此，很多研究利用壳聚糖、阿拉伯胶、果胶等多糖提高其亲水性，从而提高乳液的稳定性[2]。

研究表明，在低pH、低离子强度、高温和长时间加热条件下可促进蛋白质的展开，进而形成纤维聚合物。Gao等[3]在pH 2.0、90℃条件下加热乳清蛋白10 h后形成状态良好的纤维聚合物。纤维聚合物的形成过程分为成核期、增长期和稳定期，成核期形成的主要是纤维核[4]。纤维核属于低聚物，具有高活化能和稳定性[5]。乳清蛋白纤维核是一种具有高活化能的低聚物，是乳清蛋白纤维形成过程中一种稳定的中间产物，具有良好的溶解性和乳化性。乳清蛋白纤维核与玉米醇溶蛋白的复合纳米粒能显著提升玉米醇溶蛋白的水溶性、乳化性及稳定性[6]。

Pickering乳液是指利用固体颗粒稳定、不添加表面活性剂的乳液，近年来受到科学界的广泛关注[7]。然而，目前鲜有利用玉米醇溶蛋白颗粒稳定Pickering乳液的研究。本文基于乳清蛋白纤维核的良好溶解性和乳化性，与玉米醇溶蛋白复配，并用于制备玉米醇溶蛋白/乳清蛋白纤维核复合纳米粒稳定的Pickering乳液，探究不同复合纳米粒添加量对Pickering乳液粒径、微观形貌、储藏稳定性及流变学特性的影响，从而促进玉米醇溶蛋白作为乳化剂制备Pickering乳液的应用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

微胚乳玉米，广西益宝油料玉米开发有限公司；乳清蛋白，合肥博美生物科技有限责任公司；盐酸、氢氧化钠、碘、碘化钾，国药集团化学试剂有限公司；玉米油，购于超市；异硫氰胺荧光素、尼罗红，Sigma-Aldrich 中国有限公司。

1.1.2 仪器与设备

ME204/02电子天平、F20 pH 计，梅特勒-托利多仪器有限公司；冷冻干燥机，美国Labconco公司；Mastersizer 3000激光粒度仪，马尔文帕纳科公司；激光共聚焦显微镜，日本Olympus公司；多功能流变仪，美国TA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米醇溶蛋白的提取

将微胚乳玉米粉碎，过0.250 mm(60目)筛，按料水比1∶10加入去离子水，在60℃下加热糊化15 min，加入1.5%淀粉酶酶解，搅拌。每10 min利用碘液检测溶液中是否还有淀粉残余，直至碘液不变蓝，酶解结束，水洗，分离，所得沉淀在50℃下真空干燥10 h。

将脱淀粉样品在50℃下以料液比1∶5加入正己烷搅拌1 h，抽滤，然后重复提取，直至残油低于1%。将脱脂样品以料液比1∶10加入80%乙醇溶液超声40 min，离心，取上清液，加入与上清液等体积的4℃去离子水，静置12 h，离心，将沉淀冷冻干燥，得到玉米醇溶蛋白。

1.2.2 乳清蛋白纤维核的制备

准确称取10 g乳清蛋白，溶于250 mL去离子水中，调节pH为2，在5 000 r/min条件下离心30 min，取上清液，测定蛋白质含量，用去离子水稀释，使蛋白质含量为3%。然后调节pH为2, 在90℃水浴下加热2 h，得到乳清蛋白纤维核[8-10]。

1.2.3 玉米醇溶蛋白/乳清蛋白纤维核复合纳米粒的制备

准确称取3.0 g玉米醇溶蛋白，溶于100 mL 70%乙醇溶液作为储备液，将储备液 pH调节至2.0。配制玉米醇溶蛋白与乳清蛋白纤维核质量比2∶3的复合纳米粒溶液，利用旋转蒸发仪将混合液中乙醇除去，然后于4 000 r/min离心10 min，取上清液，使用激光粒度仪测定复合纳米粒的粒径和多分散性系数(PDI)，然后将上清液冷冻干燥，得到复合纳米粒[11]。

1.2.4 复合纳米粒乳化性的测定

为确定不同pH对复合纳米粒乳化性的影响，分别将pH为2、7、12的15 mL 0.5%复合纳米粒溶液与5 mL玉米油混合，使用高速分散机于10 000 r/min分散3 min。立即取底部乳液100 μL，加入到5 mL 0.1%SDS中混合均匀，以0.1%SDS为空白，在500 nm处测定吸光值(A)[12]。以玉米醇溶蛋白为对照。按下式计算乳化性(Es)。

(1)

式中：N为稀释倍数；C为样品中蛋白质质量浓度；Φ为油相体积分数。

1.2.5 Pickering乳液的制备

分别取1、2、3、4、5 g复合纳米粒溶于100 mL去离子水中，充分搅拌后，依次加入100 mL玉米油，于14 000 r/min高速剪切3 min，形成Pickering乳液，4℃保存备用。

1.2.6 Pickering乳液粒径的测定

分别取制备的Pickering乳液，用Mastersizer 3000激光粒度仪进行粒径的测定。水和玉米油的折射率分别是1.33和1.47。乳液的粒径以面积平均径(d(3,2))及体积平均径(d(4,3))表示[13]。

1.2.7 Pickering乳液微观形貌的表征

使用异硫氰胺荧光素和尼罗红进行染色，以异丙醇为溶剂配制1 mg/mL的异硫氰胺荧光素和尼罗红溶液， 在1 mL Pickering乳液中分别加入20 μL异硫氰胺荧光素溶液和10 μL尼罗红溶液，混匀，取10 μL染色后的乳液滴在载玻片上，盖上盖玻片后使用激光共聚焦显微镜观察乳液的微观形貌，其中尼罗红染色激发波长为488 nm，异硫氰胺荧光素染色激发波长为543 nm[14]。

1.2.8 Pickering乳液的储藏稳定性

将Pickering乳液常温储存于5 mL储藏瓶中，在储藏0、5 d时测定粒径。

1.2.9 Pickering乳液的表观黏度

使用多功能流变仪测定Pickering乳液的表观黏度[15]。测定条件：模具平板为PU40 mm，剪切速率0.1～10 s-1，间隙1 mm，25℃平衡5 min。

1.2.10 数据处理与分析

所有数据均采用Origin 2018软件绘图，SPSS软件进行显著性分析。显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 复合纳米粒的粒径与PDI值

玉米醇溶蛋白与乳清蛋白纤维核质量比2∶3制备的复合纳米粒的粒径为(205.0±4.2)nm，PDI值为0.198±0.009，表明复合纳米粒呈均一的纳米分散体系。

2.2 pH对复合纳米粒乳化性的影响

pH对玉米醇溶蛋白和复合纳米粒乳化性的影响如图1所示。

图1 pH对玉米醇溶蛋白和复合纳米粒乳化性的影响

由图1可知，随着pH的增加，玉米醇溶蛋白的乳化性先减弱后增强， pH为7时乳化性最弱，因为此时pH接近玉米醇溶蛋白的等电点(pI 6.2～6.8)[16]，分子之间的相互作用力减弱，液滴容易发生聚集，从而乳化性减弱，该结果与吴娜娜等[17]的研究结果一致。乳清蛋白纤维核有着良好的乳化性，与乳清蛋白纤维核复配后，玉米醇溶蛋白在不同pH下乳化性都有显著改善，其中中性条件下乳化性增强最为明显，可能是因为复配后等电点降低，在pH为7时蛋白质分子之间净电荷增加，相同电荷相互排斥，蛋白质颗粒凝聚减少，故液滴之间聚集减少，乳化性增强。因此，选择在中性条件下制备Pickering乳液。

2.3 Pickering乳液体系的确定

采用异硫氰胺荧光素和尼罗红分别对蛋白质和油相进行染色，然后，使用激光共聚焦显微镜观察乳液液滴的分布情况。结果显示，水相中较均匀地分布着油相液滴，复合纳米粒包裹在油滴上，制备的Pickering乳液为水包油型乳液。

2.4 复合纳米粒添加量对Pickering乳液粒径的影响

复合纳米粒添加量对Pickering乳液粒径的影响如图2所示。

图2 复合纳米粒添加量对Pickering乳液粒径的影响

复合纳米粒添加量为1、2、3、4、5 g时，Pickering乳液的d(3,2)分别为7.16、4.21、3.85、2.74、3.10 μm。所有乳液的平均粒径都在10 μm以下，随着复合纳米粒添加量的增加，乳液的平均粒径先减小后稍增大(见图2)。这与王丽娟[18]的研究结果相似。在复合纳米粒添加量较低时，颗粒多吸附于油滴表面，此时颗粒较少，乳液体系并不稳定，油滴易聚集，故粒径较大。在一定范围内，随着复合纳米粒添加量的增加，颗粒间排斥增强，油滴不易聚集，粒径变小。当达到最小粒径时，增加复合纳米粒添加量不会使粒径继续变小。

2.5 复合纳米粒添加量对Pickering乳液微观形貌的影响

复合纳米粒添加量对Pickering乳液微观形貌的影响如图3所示。由图3可知，Pickering乳液中油滴均为球型，复合纳米粒添加量少时，油滴大小不均一，体积较大的油滴周围围绕着体积较小的油滴，随着复合纳米粒添加量增大，提高了油滴间的排斥力，导致油滴尺寸变小和均匀度变好。在复合纳米粒添加量为4 g时，油滴的粒径最小且最均一，这与粒径测定结果一致。

图3 复合纳米粒添加量对Pickering乳液微观形貌的影响

2.6 复合纳米粒添加量对Pickering乳液储藏稳定性的影响

不同复合纳米粒添加量的Pickering乳液储藏0 d和5 d的粒径如表1所示。

由表1可知，储藏5 d后，不同添加量的复合纳米粒稳定的Pickering乳液粒径都有所增加，但添加量大的乳液粒径始终较小。添加量为4 g和5 g的复合纳米粒稳定的Pickering乳液在储藏5 d后粒径趋于一致。添加量为1～3 g的复合纳米粒稳定的Pickering乳液在储藏1 d后出现明显的分层现象，乳液上浮，水相析出，说明体系不稳定。储藏5 d后，添加量为4 g和5 g的复合纳米粒稳定的Pickering乳液也出现分层现象，但随着添加量的上升，乳析速率变缓。添加量为1 g的乳液水相析出明显，而添加量为5 g时乳液出现分层但界面并不明显，这说明提高复合纳米粒添加量有利于提高乳液的稳定性，因为添加量大，浓度增加，从而形成了凝胶网络结构，而这种结构对乳液稳定性十分重要[19-20]。

表1 复合纳米粒添加量对Pickering乳液储藏稳定性的影响

2.7 复合纳米粒添加量对Pickering乳液表观黏度的影响

复合纳米粒添加量对Pickering乳液表观黏度的影响如图4所示。

图4 复合纳米粒添加量对Pickering乳液表观黏度的影响

由图4可知，随着剪切速率的增大，乳液的表观黏度逐渐减小，为非牛顿流体中的假塑性流体。随着复合纳米粒添加量的增大，溶液的表观黏度先减小后增大。可能是因为在复合纳米粒添加量较低时，颗粒量不足以维持界面的稳定[21]，油滴易于聚集，从而黏度较大；随着复合纳米粒添加量增大，乳液达到最小粒径的过程中，油滴逐渐均一，流动阻力减小，使黏度减小；此后复合纳米粒添加量继续增大，不需要维持界面稳定的颗粒增多，这些颗粒相互聚集，使黏度增大。

3 结 论

为了改善玉米醇溶蛋白的水溶性和乳化性，利用反溶剂共沉淀法制备了玉米醇溶蛋白/乳清蛋白纤维核复合纳米粒，并将其用于制备Pickering乳液。结果表明：玉米醇溶蛋白与乳清蛋白纤维核复合后，乳化性明显提升，制备的Pickering乳液为水包油型乳液；在中性条件下Pickering乳液稳定性更佳；复合纳米粒添加量分别为1、2、3、4、5 g时，Pickering乳液的d(3,2)分别为7.16、4.21、3.85、2.74、3.10 μm，粒径先减小后稍增大；复合纳米粒添加量为4 g时Pickering乳液的储藏稳定性较好；随着复合纳米粒添加量的增大，Pickering乳液的表观黏度先减小后增大。