UdhA和博伊丁假丝酵母xylI基因共表达对木糖醇发酵的影响

唐梅 蔡松 付声亮 王金华 王永泽

摘要 [目的]研究可溶性吡啶核苷酸转氢酶基因（UdhA）和醛糖还原酶基因（xylI）共表达对木糖醇发酵的影响。[方法]将来源于博伊丁假丝酵母醛糖还原酶xylI基因克隆到pET28a（+）上，并在BL21（DE3）中表達，通过SDS-PAGE对表达产物的分子量和酶活进行测定。随即将xylI基因连接lacP启动子，构建pWYZ-2质粒并将其转化到E.coli AI07菌株。进一步将来源于E.coli W3110的UdhA基因克隆到pWYZ-2质粒实现与xylI共表达，所构建pWYZ-4质粒转化到E.coli AI07菌株，比较了E.coli AI07/pWYZ-2和E.coli AI07/pWYZ-4木糖醇发酵结果。[结果]在BL21（DE3）/pET28a（+）体系诱导表达的醛糖还原酶分子量为39  kD，木糖还原酶酶活为3.30 U/mL。E.coli AI07/pWYZ-2菌株发酵48 h，木糖醇产量为19.90 g/L;E.coli AI07/pWYZ-4发酵36 h，木糖醇产量达到19.91 g/L，较菌株AI07/pWYZ-2生产强度提高了33.25%。[结论]通过将UdhA基因与xylI 基因进行共表达，提高了重组大肠杆菌（E.coli AI07/ pWYZ-4）合成木糖醇的生产强度。

关键词 博伊丁假丝酵母;xylI基因;UdhA基因;共表达;木糖醇

中图分类号 Q 812  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）01-0106-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.027

The Effect of Co-expression of UdhA and Candida boidinii xylI Gene on Xylitol Fermentation

TANG Mei， CAI Song， FU Sheng-liang et al

（Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology， Hubei University of Technology， Wuhan， Hubei 430068）

Abstract [Objective] The effect of co-expression of soluble pyridine nucleotide transhydrogenase gene （UdhA） and aldose reductase gene （xylI） on xylitol fermentation was investigated. [Method] xylI gene from Candida boidinii encoding aldose reductase was cloned into pET28a（+） and expressed in BL21（DE3）. The enzyme molecular weight was detected by SDS-PAGE and enzyme activity was assayed. xylI gene was ligated to the lacP promoter for construction of plasmid pWYZ-2 and then the plasmid was transformed into E.coli AI07.The UdhA gene derived from E.coli W3110 was further cloned into pWYZ-2 plasmid to achieve co-expression with xylI for pWYZ-4 plasmid construction and then pWYZ-4 was transformed into E.coli AI07. E.coli AI07/pWYZ-2 was compared with E.coli AI07/pWYZ-4 for xylitol fermentation.[Result] The molecular weight of xylose reductase expressed in BL21（DE3）/pET28a（+） system was 39 kD， and the enzymatic activity of aldose reductase was 3.3 U/mL.The E.coli AI07/pWYZ-2 strain was fermented for 48 hours， the xylitol output was 19.90 g/L. E.coli AI07/pWYZ-4 was fermented for 36 hours， xylitol production reached 19.91 g/L， xylitol productivity of E.coli AI07/pWYZ-4 was 33.25% higher than that of strain E.coli AI07/pWYZ-2.[Conclusion]Xylitol productivity of recombinant Escherichia coli was improved using co-expression of UdhA gene and xylI gene.

Key words Candida boydingii;xylI gene;UdhA gene;Co-expression;Xylitol

基金项目 国家“十二五”支撑计划项目（2012BAD27B03）;山东创新计划项目（201720311004）。

作者简介 唐梅（1993—），女，湖北广水人，硕士，从事代谢工程及发酵技术研究。通信作者，副教授，从事生物能源与生物材料研究。

收稿日期 2021-04-22

木糖醇广泛存在于各种果蔬食物中，含量却很低[1]，其应用范围广，且由于木糖醇在人体内的代谢与胰岛素无关[2-3]，故适用于生产糖尿病患者食品。近年来，木糖醇的市场需求不断扩大，国内木糖醇年产值已超过13亿元，预计今后国际市场上木糖醇总需求量将达10万t以上[4]。

通过微生物发酵或者催化获得木糖醇正成为木糖醇合成的热点，醛糖还原酶（也称为木糖还原酶）作为生物合成法中的关键因子，主要存在于酵母和丝状真菌中[4]。目前发现的醛糖还原酶都需要辅酶，其中一类是辅酶NADH依赖型，如来源于近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）[5]的木糖还原酶;另外一类是辅酶NADPH依赖型，如来源于热带假丝酵母（Candida boydingii）[6]、埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii）[7]和博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）等[8]微生物的醛糖还原酶。对于辅酶NADPH依赖型的木糖还原酶，要提高木糖醇的产量，需要更多的NADPH来满足酶催化的需要。

通常通过表达磷酸戊糖途径的6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因zwf和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因gnd来强化NADPH的产出[9];也有敲除EMP途径中编码磷酸果糖激酶的pfkA和pfkB基因，使碳源更多地流向磷酸戊糖途径，从而实现NADPH的供给[10]。

可溶性吡啶核苷酸转氢酶能催化NADH和NADPH相互转化[11]，改变了细胞内NADH/NAD+的比例。考虑到糖酵解途径不依赖氧气也能产生大量的NADH，如果将这部分辅因子转化成NADPH形式，将为NADPH的供给提供一个新的途径。在前期产丙酮酸大肠杆菌工程菌构建的工作中，成功将大肠杆菌W3110自身的UdhA基因克隆到载体上，通过诱导表达发现，UdhA的克隆有效地促进了丙酮酸发酵的生产强度[12]。

考虑到博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）在木糖醇合成中也存在辅酶NADPH依赖的难题，笔者借鉴丙酮酸工程菌构建的结果，将博伊丁假丝酵母的醛糖还原酶基因xylI进行克隆、表达及酶活测定，并探讨可溶性吡啶核苷酸转氢酶UdhA和xylI共表达对木糖醇发酵的影响，以期为解决NADPH依赖型醛糖还原酶辅因子不足的问题提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒。所用菌株和质粒见表1。

1.1.2 引物。

引物序列见表2，均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.3 主要试剂与仪器。

主要试剂：木糖醇对照品（含量>99.9%），2×Taq polymerase，PrimerSTAR Max DNA Polymerase，其他试剂均为市售分析纯;主要仪器：e2695液相色谱、蛋白电泳仪、凝胶自动成像仪、PCR仪、电转仪。

1.1.4 培养基。

LB液体培养基：酵母粉5 g/L、蛋白胨1 g/L、NaCl 5 g/L。

抗性平板培养基：酵母粉5 g/L、蛋白胨1 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂粉20 g/L，根据用途加入50 mg/L氨苄青霉素或者卡那霉素。

摇瓶种子培养基：葡萄糖20 g/L、木糖1 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨1 g/L、NaCl 5 g/L、氨苄青霉素50 mg/L。

摇瓶发酵培养基：葡萄糖20 g/L、木糖20 g/L、酵母粉5 g/L。

1.2 方法

1.2.1 将xylI基因克隆到载体pET28a（+）。

（1）以质粒pAGI02作为模板，采用引物pET28a（+）-xylI（AR）-p1和pET28a（+）-xylI（AR）-p2扩增出理论长度为1 016 bp的xylI核酸序列。

（2）以pET28a（+）作為模版，采用反向引物pET28a（+）-p-F-P1和pET28a（+）-p-F-P2将pET28a（+）线性化，得到理论长度为5 000 bp的核酸序列。

（3）采用T5外切酶[13]的方法处理xylI核酸序列和pET28a（+）线性化的核酸序列，处理后的产物用氯化钙法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，30 ℃ 150 r/min复苏40 min后取100 μL菌液涂布于卡那抗性平板上，待卡那抗性平板上长出单菌落后，挑取单菌落提取重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司武汉分公司测序，将测序无误的重组质粒命名为pET28a（+）-xylI。

（4）将重组质粒pET28a（+）-xylI采用氯化钙法转化到E.coli BL21中，得到菌株BL21/pET28a（+）-xylI。

1.2.2 将xylI基因克隆到载体pBR322。

（1）以质粒pBR322作为模版，采用反向引物pBR322-F-P1和pBR322-F-P2将pBR322线性化（线性化序列为除去tetP和Tcr部分的序列），得到理论长度为3 094 bp的核酸序列。

（2）以pWYZ-1质粒作为模版，设计引物pBR322-lacP-xylI P1和pBR322-lacP-xylI P2，从pWYZ-1质粒上扩增出lacP-xylI核酸序列，大小为1 168 bp。

（3）用T5外切酶的方法[13]处理lacP-xylI核酸序列和pBR322载体线性化的核酸序列，处理后的产物用氯化钙法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，30 ℃150 r/min复苏40 min后取100 μL菌液涂布于氨苄抗性平板上，待氨苄抗性平板上长出单菌落后，挑取单菌落提取重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司武汉分公司测序，将测序无误的重组质粒命名为pWYZ-2。

（4）将重组质粒pWYZ-2采用氯化钙法转化到E.coli AI07中，得到菌株E.coli AI07/pWYZ-2。

1.2.3 将UdhA基因克隆到载体pWYZ-2。

（1）以pWYZ-2质粒为模板，采用反向引物pWYZ-2-P1和pWYZ-2-P2将pWYZ-2线性化，得到理论长度为4 212 bp的核酸序列。

（2）以E.coli W3110[14]为模板，使用引物UdhA-P1和UdhA-P2扩增出理论长度为1 401 bp的UdhA核酸序列。

（3）用T5外切酶的方法将扩增出的UdhA核酸序列与pWYZ-2线性化的核酸序列进行外切处理，处理后的产物用氯化钙法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，30 ℃150 r/min复苏40 min后取100 μL菌液涂布于氨苄抗性平板上，待氨苄抗性平板上长出单菌落后，挑取单菌落提取重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司武汉分公司测序，将测序无误的重组质粒命名为pWYZ-4。

（4）将重组质粒pWYZ-4采用氯化钙法转化到E.coli AI07中，得到菌株E.coli AI07/pWYZ-4。

1.2.4 SDS-PAGE分析粗酶液中重组蛋白的分子量。

从甘油管中将菌株BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI转接到固体平板，于37 ℃培养箱过夜培养;从卡那平板挑取单克隆BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI接种于含卡那的50 mL LB液体培养基中，于37 ℃ 200 r/min培养至OD600=0.6～0.8，再将菌液温度降至25 ℃以下，加入诱导剂IPTG至最终浓度为1 mmol/L，25 ℃诱导15 h，取2 mL菌液于2 mL离心管中，12 000 r/min 4 ℃离心5 min，使用1 mL预冷的低盐PBS清洗菌体3遍。每管加入1 mL预冷的裂解液重悬细菌，冰浴超声400 W，超10 s停10 s，超声10 min直至变清，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，收集上清即为粗酶液作为样品进行SDS-PAGE电泳。

1.2.5 菌株BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI表达产物的酶活测定。

酶活测定参照张哲等[10]的方法。

对于醛糖还原酶，1个酶活性单位（U）定义为在35 ℃反应条件下1 min消耗1 μmol NADPH所需的酶量。

1.2.6 重组大肠杆菌摇瓶发酵试验。

分别从甘油管将E.coli AI07/pWYZ-2和E.coli AI07/pWYZ-4菌株转接到氨苄抗性平板上，并转接数代;然后从抗性平板上挑取3个菌落到50 mL摇瓶种子培养基中。30 ℃ 200 r/min过夜培养，然后按照2%接种量接种于含有100 mg/L氨苄青霉素的100 mL发酵培养基中，30 ℃ 200 r/min条件下进行发酵，当摇瓶中菌液OD600达到0.8～1.0时，添加0.1 mmol/L IPTG开始诱导。每12 h向发酵摇瓶中补加氨苄青霉素100 μL（100 mg/L）;每12 h从摇瓶取出2 mL发酵液。

1.2.7 产物检测。

用可见分光光度计测定“1.2.6”中取出的发酵液中菌的OD600吸光值，用来评价菌的生物量。

将“1.2.6”中取出的发酵液12 000 r/min离心5 min，取上清用超纯水稀释合适倍数后，用0.22 μm滤膜过滤。采用高效液相色谱waters e2695测定发酵液的木糖醇、D-木糖和葡萄糖。色谱柱为Bio-Rad HPX 87H，检测器为示差检测器（2414 RI Detector），流动相4 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，柱温40 ℃。

2 结果与分析

2.1 pET28a（+）-xylI、pWYZ-2和pWYZ-4目标载体的成功构建

图1～3为3个质粒构建的示意图，并将测序正确的质粒分别命名为pET28a（+）-xylI、pWYZ-2和pWYZ-4。

2.2 質粒 pET28a（+）-xylI中xylI基因的诱导表达

将重组大肠杆菌 BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI进行IPTG诱导表达，将诱导表达后的发酵液进行超声波破胞后离心，以离心后的上清液作为样品，进行SDS-PAGE 蛋白电泳（胶浓度为12%），结果见图4。从图4可见，重组大肠杆菌 BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI经过IPTG诱导表达后，在39 kD处出现明显的蛋白表达条带（泳道2），而未添加IPTG诱导表达的对照组（泳道1）在相应的位置蛋白表达条带很淡，可初步推断醛糖还原酶分子量约为 39 kD，这也与xylI基因预测表达产物分子量大小相符。

2.3 醛糖还原酶酶活测定结果

将重组大肠杆菌 BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI进行IPTG诱导表达，将诱导表达后的发酵液进行超声波破胞后离心，以离心后的上清液作为样品，测定醛糖还原酶的酶活，结果表明，BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI不添加IPTG的酶活为（0.04±0.03） U/mL，

BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI 添加IPTG的酶活为（3.30±0.06） U/mL。

2.4 E.coli AI07/pWYZ-2和E.coli AI07/pWYZ-4菌株发酵结果

在大肠杆菌 BL21（DE3）验证了xylI基因表达产物及测定了相应醛糖还原酶酶活后，将xylI基因连接上lacP启动子，重新构建了质粒pWYZ-2，以强化菌株E.coli AI07产木糖醇的能力。在pWYZ-2基础上，进一步共表达xylI基因和UdhA基因，得到了质粒pWYZ-4。通过对比菌株E.coli AI07/pWYZ-2和E.coli AI07/pWYZ-4发酵产木糖醇的结果，评价UdhA基因对木糖醇发酵的影响。

由图5可知，在整个发酵过程中，E.coli AI07/pWYZ-4菌株的生物量（OD600值）始终高于菌株E.coli AI07/pWYZ-2;在利用葡萄糖方面，菌株E.coli AI07/

pWYZ-2在发酵24 h后葡萄糖剩余量为7.2 g/L，而菌株E.coli AI07/pWYZ-4发酵24 h后，葡萄糖剩余量为2.1 g/L，表明E.coli AI07/pWYZ-4对葡萄糖消耗较快，也解释了其在发酵过程中较高的生物量;在利用木糖方面，当初始D-木糖的量为20 g/L时，E.coli AI07/pWYZ-2菌株48 h，木糖醇的产量为19.90 g/L;而菌株E.coli AI07/pWYZ-4 36 h，木糖醇的产量为19.91 g/L。E.coli AI07/pWYZ-4菌株较E.coli AI07/pWYZ-2生产木糖醇的强度提高了33.25%。

UdhA基因能够催化NADH与NADPH相互转化，进而调控胞内还原力[15]，而NADPH是很多菌属包括该研究所用的博伊丁假丝酵母醛糖还原酶的辅酶[16]，由此推断，共表达UdhA能调动糖酵解产生的NADH生成NADPH，从而提高木糖醇的产量。但从已有的发酵数据来看，共表达UdhA基因的E.coli AI07/pWYZ-4菌株并未形成更高的木糖醇产量，只是有较高的木糖醇生产强度，推测可能原因在于UdhA基因并不仅仅影响辅酶含量，而是通过一些途径影响细胞生长或相关酶的酶活，从而提高木糖醇的生产强度。

3 结论

（1）博伊丁假丝酵母醛糖还原酶（xylI）基因在BL21（DE3）/pET28a（+）体系诱导表达后的蛋白产物分子量为39 kD，醛糖还原酶酶活为3.30 U/mL。

（2）将博伊丁假丝酵母醛糖还原酶（xylI）基因接lacP启动子，克隆到pWYZ-2质粒并转化到E.coli AI07菌株后发酵48 h，木糖醇的产量为19.90 g/L。

（3）共表达来自E.coli W3110的可溶性吡啶核苷酸转氢酶基因（UdhA）对于Candida boidinii这类醛糖还原酶依赖NADPH辅因子的菌属来说，具有提高生产强度的作用，该研究中木糖醇的生产强度提高了33.25%。

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