四川地区大口黑鲈源鰤诺卡菌耐药性与耐药基因分析

康振亚，雷雪平，陈梦竹，郭向辉，耿毅，欧阳萍，陈德芳，黄小丽

1.四川农业大学动物医学院，成都 611130； 2.四川农业大学动物科技学院，成都 611130

大口黑鲈(Micropterussalmoides)又称加州鲈，属鲈形目(Perciformes)、太阳鱼科(Cehtrachidae)、黑鲈属(Micropterus)，具有适应性强、生长快、易起捕、养殖周期短等优点，已成为我国淡水养殖的新兴重要品种[1]。鰤诺卡菌(Nocardiaseriolae)是鱼类诺卡菌病的主要来源，自1968年从患病鰤(Seriolaquinqueradiata)中分离[2]以来，该菌在全球多个国家与地区报道可感染大口黑鲈[3]、乌鳢[4]、鳗鲡[5]等多种鱼类。随着我国大口黑鲈养殖产业的快速发展，N.seriolae成为威胁产业发展的重要病原菌，尽管目前已有针对该菌的疫苗被研发，并有较好免疫效果[6]，抗生素仍是防治N.seriolae感染的主要手段，然而N.seriolae耐药性日益增强给有效用药带来巨大困难。四川是我国大口黑鲈养殖与消费大省，但目前对于大口黑鲈N.seriolae的耐药性与耐药基因流行情况还不清楚。本研究从主养区采集疑似N.seriolae感染大口黑鲈分离鉴定20株N.seriolae并检测耐药性与耐药基因，以明确四川大口黑鲈主养区的N.seriolae的耐药表型与耐药基因的流行情况，旨在为药物防控提供用药依据，并为其耐药机理阐释提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 N. seriolae分离与鉴定

2018年在四川绵阳、德阳、蒲江、新津等大口黑鲈养殖区采集疑似N.seriolae感染、体质量250～ 400 g的患病大口黑鲈共69尾。无菌条件下，从病鱼的肝、脾和肾取样接种于BHI平板，28 ℃培养5～7 d，挑取白色或淡黄色、表面粗糙、干燥的疑似N.seriolae的菌落纯培养后，参照文献[7-8]合成16S rDNA基因 (P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；P2：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′)和hsp65 基因(P1：5′-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3′；P2：5′-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3′)的扩增引物，对分离菌进行相应基因的PCR扩增与测序。测序后在GenBank中BLAST比对并采用Neighbor-Joining法构建系统发育树(MEGA 7. 1)。鉴定的N.seriolae于-20 ℃保存备用。

1.2 N. seriolae耐药表型测定

使用上海星佰生物技术有限公司提供的动物源性细菌耐药性检测板，参照文献[9]推荐的微量肉汤稀释法测定青霉素、头孢噻呋、头孢西丁、奥格门汀、苯唑西林、恩诺沙星、氧氟沙星、磺胺异恶唑、复方新诺明、氟苯尼考、泰妙菌素、多西环素、红霉素、替米考星、庆大霉素、万古霉素、利奈唑胺和克林霉素等18种药物(上海星佰生物技术有限公司)对N.seriolae的MIC，并根据文献[9]判定药物的敏感性。

1.3 N. seriolae 耐药基因检测

使用北京天根公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，参照文献[10]采用WaferGenSmartChip超高通量荧光定量PCR法检测耐药基因，设计合成6类(四环素类、氯霉素类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、MLSB、多重耐药类[11])共78种耐药基因检测引物。反应程序为95 ℃预变性20 s; 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环；熔解曲线反应条件为95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。检测结果使用SmartChip超高通量荧光定量PCR系统分析软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 N. seriolae 形态特征与基于16S rDNA基因和hsp65基因的系统发育分析

2018年从四川德阳、绵阳、新津、蒲江采集的患病大口黑鲈体内分离到N.seriolae疑似菌20株(表1)，其中新津6株，命名为XJ01～XJ06；蒲江4株，命名为PJ01～PJ04；德阳6株，命名为DY01～DY06；绵阳4株，命名为MY01～MY04。分离菌在BHI平板上28 ℃培养7～10 d后呈白色或淡黄色、表面粗糙、易碎、干燥、边缘不整齐的菌落；在BHI液体培养基中易发生聚集，且生长缓慢。菌体呈革兰阳性，弱抗酸性，细长杆状或分枝状，无孢子。20株分离菌的16S rDNA基因与hsp65基因经PCR扩增获得预期大小分别为1 500 bp与400 bp的片段，GenBank登录号分别为MKO45204-MKO45223与MH973626-973634。将20株分离菌的16S rDNA基因和hsp65基因测序与GenBank己知核酸序列进行BLAST比对，发现与N.seriolae的相似性最高，达95%以上。在以16S rDNA基因序列、hsp65基因序列及GenBank中其他诺卡菌属菌株相应序列建立的系统发育树上(图1)，20株分离菌与N.seriolae聚为一族，结合分离菌的形态特性，鉴定20株分离菌为N.seriolae。

表1 分离菌基本信息 Table 1 Basic information of isolated bacteria

2.2 分离菌株的耐药表型

20株分离菌N.seriolae的药敏结果(图2)显示，分离菌对β-内酰胺类、喹诺酮类和磺胺类药物的耐药性较高，对青霉素、头孢噻呋、头孢西丁、奥格门汀和苯唑西林5种药物耐药率均为100%；对恩诺沙星耐药率为45%，对氧氟沙星耐药率为75%；对复方新诺明与磺胺异恶唑耐药率均为40%；而对多西环素、红霉素和替米考星、庆大霉素、万古霉素、利奈唑胺和克林霉素等药物的药物敏感率为100%。分离的10株N.seriolae表现出对3～5类药物的多重耐药性，其中耐3类药物的细菌有5株(DY03、DY04、MY02、PJ03、PJ04)，耐4类药物的细菌有4株(DY02、MY03、XJ03、XJ04)，耐5类药物的细菌有1株(XJ02) 。

2.3 分离菌株耐药表型的地区性特征

对不同地区分离株药物敏感性分析(图3)发现，德阳分离株耐药率最高，新津分离株耐药种类和多重耐药分离株最多。耐喹诺酮类药物的分离株主要分布于德阳、绵阳、蒲江，新津分离株对喹诺酮类药物中度敏感；耐磺胺类药物的分离菌主要分布于新津与德阳。氟苯尼考在绵阳、蒲江、新津地区呈中度敏感至耐药。泰妙菌素在部分分离菌中表现为耐受，新津分离菌占比最大。

2.4 分离菌株的耐药基因分析

对20株N.seriolae的耐药基因检出率与丰度见图4。四环素类基因tetA、tetG检出率100%，tetD、tetM检出率85%；MLSB类检出率较高的基因为mphA、mefA，检出率分别为75%、65%；氨基糖苷类检出率最高的是aacC、aac(6′)—Ⅱ，检出率分别为100%、89%；β-内酰胺类检出率较高的基因为blaTEM，检出率为100%；氯霉素类检出率较高的是fioR、catB3、catB8、cmx(A)，检出率分别为100%、95%、95%、95%；多重耐药基因检出率较高的是acrA、acrB、acrF，检出率分别为100%、100%、95%。所有分离菌中tetA、tetG、blaTEM、floR、cat、aacC、acrA、acrB、acrF基因检出率为95%～100%，其中blaTEM、tetA基因整体丰度较高。

奥格门汀=阿莫西林/克拉维酸；复方新诺明=甲氧卞定/磺胺甲恶唑。Augmentin=Amoxicillin/Clavulanic acid； Compound sulfamethoxazole tablets=Methoxybiidine/Sulfamethoxazole.

图3 整体耐药统计与不同地区分离株耐药统计Fig.3 Overall resistance statistics and resistance statistics of 20 N. seriolae isolates in different regions

A.分离菌耐药基因丰度 Abundance of drug-resistant genes in isolates; B. 分离菌耐药基因检测率 Rates of drug resistance gene detection of isolates.

2.5 不同地区分离菌株的耐药基因特征

对不同地区分离N.seriolae的耐药基因检测结果分析发现，各地分离菌耐药基因检出率与丰度存在差异(图5)，蒲江、新津分离菌β-内酰胺类耐药基因检出率与丰度较高；蒲江、新津、绵阳分离菌氯霉素类耐药基因检出率与丰度较高；蒲江、新津、绵阳分离菌四环素类耐药基因检出率与丰度较高；绵阳、新津分离菌MLSB类耐药基因检出率与丰度较高；德阳、绵阳、新津分离菌氨基糖苷类耐药基因检出率与丰度较高；多重耐药基因在每个地区检出率与丰度均很高。

3 讨 论

本研究于2018年从四川主要大口黑鲈养殖区采集内脏器官出现白色结节疑似N.seriolae感染的病料，分离鉴定20株N.seriolae，比较16S rDNA测序结果与hsp65基因测序结果可见，不同地区分离菌间无显著差异。药敏结果显示20株菌对β-内酰胺类完全耐药，对喹诺酮类药物和磺胺类药物耐药率也较高，对氟苯尼考中度敏感，对多西环素、替米考星等敏感，该结果与蒋依依等[12]、何晟毓等[13]研究结果存在一定差异，可能与不同分离株自身特性有关。

细菌耐药表型通常由耐药基因介导，本研究中6类耐药基因在20株N.seriolae中均能检出，但只有β-内酰胺类药物表现为全部耐药而其他类药物的耐药表型与耐药基因则未表现出完全的一致，这可能是耐药基因表达量低或不表达[14]，或者是细菌处于异质性耐药[15]所致，因此，对于耐药基因表达的调控机制需深入研究，以便能为细菌耐药表型的控制提供新的策略。对20株N.seriolae检出耐药基因介导的耐药机制分析发现主要为外排泵机制，这与四川地区维氏气单胞菌[16]、鲁氏耶尔森菌[17]等水产病原菌的主要耐药机制相似，外排泵机制会导致细菌多重耐药[18]，本研究中也发现10株菌表现为多重耐药，由此可见，四川大口黑鲈N.seriolae具有进一步进化为多重耐药菌的潜在风险，未来需加强基因监测与风险评估。

本研究中不同地区分离菌耐药基因检出率与丰度存在差异较小，可能是由于本次分离地区同处于四川流域，不同地区的分离菌存在基因交流。基因交流有利于耐药基因扩散、积累[19]，耐药基因能以水环境为媒介，通过质粒介导进入其他细菌体内，这增加了超级细菌出现的风险。本研究发现，同一地区N.seriolae的耐药基因分布具有一定相似性，但不同地区间分离株的耐药基因分布具有较大差异，因此，应在大口黑鲈苗种流通环节加强N.seriolae的产地检疫，降低菌株间发生基因交流的机会。