基于激光诱导击穿光谱的柑橘叶片黄龙病检测

欧阳爱国，刘晓龙，李斌，林同征，刘燕德，黄敏，宋烨

1.华东交通大学智能机电装备创新研究院， 南昌 330013； 2. 江南大学轻工过程先进控制教育部重点实验室， 无锡 214122； 3.济南果品研究院， 济南 250000

柑橘是世界上重要的经济作物[1]。目前，柑橘产业的发展受到各种病害的侵袭和威胁，其中，柑橘黄龙病是柑橘生产中威胁最大的毁灭性病害[2]。柑橘黄龙病的发病症状主要表现为患病植株长势衰退，抽梢短而小，树叶出现斑驳性黄化和整体黄化枯萎，柑橘植株果实变小且果柄端橘红色，其余部分青色，俗称红鼻子果[3-4]。对发病轻的柑橘果树，挖除病株后可采用无病苗补植，然后加强对黄龙病的监测和防治；当柑橘黄龙病发生的范围很广时，应将全园的苗木都挖掉，重新栽种未受该病影响的苗木。找到一种快速、有效、无损的柑橘叶片黄龙病检测方法，对柑橘产业健康持续发展具有重要意义。

柑橘黄龙病的传统诊断方法主要有田间症状诊断法、电镜观察法以及PCR检测法等[4-6]。由于黄龙病症状非常复杂，上述检测方法在对柑橘黄龙病检测中都存在不足之处。其中，田间症状诊断法的缺点是主观性较强，准确率不高[6-7]；病菌分布大小不均匀和采集方法不正确会导致电镜观察法准确率不高[7]；血清学检测法抗体的制备技术复杂以及检测范围较窄[8]；PCR检测则成本较高，不适合用于大田果园批量检测[9]。为此，研究人员尝试采用无损检测方法来检测或及时发现病树，如王凡等[10]利用高光谱技术对黄龙病进行检测并对病害进行了分类；刘燕德等[11]采用近红外光谱对感染黄龙病的柑橘叶片、缺素叶片及健康叶片等样品进行了分析。但高光谱和近红外存在图谱结合比较复杂、测定精度不高等缺点。激光诱导击穿光谱技术(laser-induced breakdown spectroscopy,LIBS)[12]能够检测试验样品中元素的光谱强度，可以用于农业研究。如章琳颖等[13]运用九点平滑(SM)结合多元散射校正(MSC)对脐橙果汁进行LIBS数据预处理，然后采用主成分分析(PCA)结合多层感知器神经网络(MLP)和径向基函数神经网络(RBF)模型对健康和感染黄龙病的脐橙进行快速判别。刘燕德等[14]采用MSC光谱预处理方法和PCA分类法，并建立三维模型分析，可以很好地将感染炭疽病的油茶叶片和健康油茶叶片区分开来，建立的PLS-DA模型的识别率为90%。

LIBS在植物病害检测中具有比较简单、方便、新颖和突出等特点，目前有关LIBS应用于柑橘叶片病害检测的研究报道不多。柑橘叶片的生长情况可直接反映柑橘果树及整个种植区柑橘果实的健康程度。本研究基于健康柑橘叶片和感染黄龙病柑橘叶片的LIBS及其光谱响应，建立基于LIBS的柑橘叶片黄龙病检测方法，旨在进一步扩展LIBS的应用范围，并为柑橘叶片营养元素的检测提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 样品制备

1)样品采集。2020年10月在江西省赣州市的果园采集柑橘的健康叶片、中度感染黄龙病的叶片和重度感染黄龙病的叶片各100片。将摘取到的鲜叶放入保鲜袋中保存，并将冰袋放入其中保证柑橘叶片的新鲜度。

2)样品制备。采用去离子水反复冲洗叶片表面，去除柑橘叶片表面上灰尘和泥垢；再用吸水纸擦拭，在通风处放置2 h，让其自然晾干，以减少水珠对试验结果的影响。最后装袋并分类标号。

1.2 试验设备

本研究采用的LIBS试验设备为MX2500+(海洋光学)，其系统原理图如图1所示。Nd：YAG激光器在纳秒量级的范围内激发出能量较高、脉宽较大的激光，经反射后由透镜聚焦到柑橘叶片表面，然后击打叶片表面产生等离子体。由光纤收集后传输到5通道多谱仪。通过MX2500+所配套的MaxLIBS软件对元素的波长和光谱强度进行采集。

图1 LIBS系统原理图Fig.1 A schematic diagram of LIBS system

激光能量设置为50 mJ，光谱仪的波长范围为198.71～727.69 nm，光学分辨率0.1 nm，延迟时间设定为2 μs。在采集过程中，每个叶片样品重复采集6个LIBS光谱数据，这样可以涉及叶片的不同部位。再将采集到的6个LIBS光谱数据的平均值作为试验分析数据，目的是为了减小误差和样品的不平整性对试验结果的影响。

1.3 数据处理

数据预处理的目的在于除去数据中含有的噪音和无用的信息，如激光器激光能量的波动、光谱仪分辨率的差异、外部环境的差异以及样品不均匀等因素，提高建立模型的预测精度，增强建立模型的稳健性[14]。本研究采用归一化(normalization)、多元散射校正(multiplicative scatter correction,MSC)、标准正态变换(standard normal variate,SNV)和正交信号校正(orthogonal signal correction,OSC)4种光谱预处理方法[15]。

偏最小二乘是最常用的多元线性校正技术，可以同时分解光谱矩阵X和浓度矩阵Y，消除无用的噪声信息，使其在实际应用中具有更强的鲁棒性[16]。模型公式如下：

Y=bX+e

(1)

式(1)中，b表示回归系数的向量，e表示模型残差。

根据NIST的标准原子光谱数据库，预选光谱P(Ⅱ)645.999 nm，Mn(Ⅰ)279.483 nm，Mn(Ⅰ)280.379 nm，Si(Ⅰ)251.432 nm和Fe(Ⅰ)252.285 nm这5条LIBS光谱作为分析感染黄龙病柑橘叶片的谱线。这些微量元素与柑橘叶片组织密切相关，即能区分柑橘叶片是否健康。采用Unscrambler10.1软件中的Normalization、MSC、SNV和OSC 4种预处理方法和偏最小二乘判别分析(partial least square discriminant analysis,PLS-DA)对LIBS光谱数据进行分类处理。

2 结果与分析

2.1 叶片LIBS光谱特征分析

P(Ⅱ)的LIBS特征光谱如图2所示。由图2可知，P(Ⅱ)的特征光谱在波长645.999 nm处，健康柑橘叶片的P(Ⅱ)特征光谱强度明显高于感染黄龙病的柑橘叶片，并且健康柑橘叶片、中度感染黄龙病的柑橘叶片和重度感染黄龙病的叶片的P(Ⅱ)特征光谱强度呈线性下降。P有利于植物的新陈代谢，能使叶片变得更加耐旱和耐寒。如果柑橘叶片中的P含量较低，就会影响植物的新陈代谢。

图2 柑橘叶片在644～650 nm 波长范围内P(Ⅱ)的LIBS光谱Fig.2 P(Ⅱ) LIBS spectra of citrus leaves in the wavelength range of 644-650 nm

Mn(Ⅰ)的LIBS特征光谱如图3所示。由图3可知，Mn(Ⅰ)的特征光谱谱线在279.483 nm和280.379 nm处。可以发现感染黄龙病柑橘叶片中Mn(Ⅰ)的特征光谱强度明显低于健康柑橘叶片中的Mn(Ⅰ)的特征光谱强度。原因是Mn是维持叶绿体结构必不可少的微量元素。当叶片非常缺乏Mn时，叶脉间会逐渐出现黄化。

Si(Ⅰ)和Fe(Ⅰ)的LIBS特征光谱如图4所示。由图4可知，Si(Ⅰ)和Fe(Ⅰ)在波长251.432 nm和252.285 nm处有明显的特征峰，通过对比图4中的强度值，健康柑橘叶片中Si(Ⅰ)的特征光谱强度明显高于感染黄龙病柑橘叶片中Si(Ⅰ)的特征峰。Si在植物生长中扮演着重要的角色，并且能抵抗攻击植物的病原体。健康柑橘叶片中高含量的Si对抗病原体有着很重要的作用；但感染黄龙病的柑橘叶片中Si含量较低，是因为受到了黄龙病的危害。此外，健康柑橘叶片中Fe(Ⅰ)的特征光谱强度要比感染黄龙病柑橘叶片中Fe(Ⅰ)的特征光谱强度高，原因是Fe是形成叶绿素不可或缺的微量元素之一，健康柑橘叶片中含有的大量Fe参与氧化还原反应，促进氮素代谢，并且能增强植株的抗原体，而感染黄龙病的柑橘叶片的表面上出现病斑且病斑周围呈淡黄色，出现缺铁变黄的症状。

图3 柑橘叶片在278～281 nm 波长范围内Mn(Ⅰ)的LIBS光谱Fig.3 LIBS spectra of Mn(Ⅰ)in citrus leaves in the wavelength range of 278-281 nm

图4 柑橘叶片在250～254 nm波长范围内 Si(Ⅰ)和Fe(Ⅰ)的LIBS光谱Fig.4 LIBS spectra of Si(Ⅰ)and Fe(Ⅰ)in the wavelength range of 250-254 nm in citrus leaves

综上，感染黄龙病的柑橘叶片中P(Ⅱ)、Mn(Ⅰ)、Si(Ⅰ)和Fe(Ⅰ)的特征光谱强度显著低于健康柑橘叶片中P(Ⅱ)、Mn(Ⅰ)、Si(Ⅰ)和Fe(Ⅰ)的特征光谱强度。而且柑橘叶片中的P、Mn、Si和Fe的LIBS信号强度与叶片的健康状态有着很强的相关性，LIBS信号强度随着叶片的病害加重而逐渐减弱。因此，选用P(Ⅱ)645.999 nm、Mn(Ⅰ)279.483 nm、Mn(Ⅰ)280.379 nm、Si(Ⅰ)251.432 nm和Fe(Ⅰ)252.285 nm等5条LIBS特征光谱对健康、中度感染和重度感染黄龙病的柑橘叶片等3种情形进行分析。

2.2 单个特征光谱和特征光谱融合的PLS-DA

使用300个样本用于建立偏最小二乘判别模型，其中健康柑橘叶片、中度感染黄龙病和重度感染黄龙病的柑橘叶片分别为100片。首先人为设定健康柑橘叶片样品为1，感染中度黄龙病的柑橘叶片为2，感染重度黄龙病的柑橘叶片为3。若预测值介于0.5和1.5之间则判定为健康柑橘叶片，若预测值介于1.5和2.5之间则判定为中度感染黄龙病的柑橘叶片，若预测值介于2.5和3.5之间则判定为是重度感染黄龙病的柑橘叶片。然后将300个柑橘叶片样本按照3∶1的比例随机分为建模集(225个样本)和预测集(75个样本)。

从表1中可知，在没有预处理的情况下，当5个特征光谱单独用PLS-DA建模分析时， Fe(Ⅰ)的建模集均方根误差(root mean square error of calibration,RMSEC)为0.394，建模集相关系数(correlation coefficient of calibration,Rc)为0.871，总误判率为23.1%；预测集均方根误差(root mean square error of prediction,RMSEP)为0.454，预测集相关系数(correlation coefficient of prediction,Rp)为0.841，总误判率为26.6%。将5条特征光谱进行光谱融合，可以看到建模效果有所提高，模型的RMSEC为0.341，Rc为0.905，总误判率为15.5%，RMSEP为0.395，Rp为0.867，总误判率为22.7%。图5为元素Fe(Ⅰ)特征光谱的建模模型结果，图6 为5种特征光谱融合的建模模型结果。

表1 单个特征光谱和5个特征光谱融合的PLS-DA模型结果 Table 1 The results of PLS-DA model combining single feature spectra and five feature spectra

A:建模集 Modeling set; B:预测集 Prediction set； H:健康的柑橘叶片 Citrus leaf of healthy; MI：中度感染黄龙病的柑橘叶片 Citrus leaf moderately infected with Huanglongbing; SI：重度感染黄龙病的柑橘叶片Citrus leaf severely infected with Huanglongbing。下同 The same as below.

A:建模集 Modeling set; B:预测集模型 Prediction set.图6 5个特征光谱融合的PLS-DAFig.6 PLS-DA model for the fusion of five feature spectra

2.3 基于不同预处理方法的PLS-DA

5个特征光谱融合之后，根据3∶1比例划分好的建模集和预测集建立柑橘叶片的PLS模型，并使用4种预处理方法(Normalization、MSC、SNV、OSC)对光谱进行处理，结果见表2。由于OSC是通过正交投影除去光谱阵中无关的信息，再进行多元校正运算，以达到简化模型以及提高模型预测能力的目的。因此，选取OSC预处理后，所建立的模型最佳，其中RMSEC为0.027，Rc为0.994，总误判率为0；RMSEP为0.023，Rp为0.995，总误判率为0。图7为结合预处理后最优的PLS-DA模型。

表2 不同预处理方法的PLS-DA模型结果 Table 2 PLS-DA model results of different pretreatment method

A:建模集 Modeling set; B:预测集 Prediction set.图7 OSC预处理后的PLS-DAFig.7 PLS-DA model after OSC pretreatment

3 讨 论

营养元素的变化作为判别植物是否染病的重要指标之一，对早期柑橘黄龙病的检测具有重要的意义。本研究分析了柑橘叶片中P(Ⅱ)、Mn(Ⅰ)、Si(Ⅰ)和Fe(Ⅰ)元素的LIBS光谱特征，发现这4种元素的LIBS信号特征光谱的强度与柑橘叶片是否感染黄龙病有关，随着柑橘叶片感染黄龙病的程度加重，LIBS信号特征光谱的强度逐渐降低。另外，Fe(Ⅰ)的特征光谱用PLS-DA建模判别，建模集的误判率为23.1%，预测集的误判率为26.6%；将5条特征光谱融合在一起用PLS-DA建模判别，建模集的误判率为15.5%，预测集的误判率为22.7%。进一步利用OSC预处理方法并用PLS-DA建模方法进行建模判别，模型的识别率能达到100%，可以较好地区分健康柑橘叶片、中度感染黄龙病的柑橘叶片和重度感染黄龙病的柑橘叶片这3种状态，并且RMSEC、RMSEP均有所降低，Rc和Rp均有所提高，说明模型经过预处理优化后剔除了大量噪声信息，从而提高了模型的准确性和稳定性。研究显示，采用激光诱导击穿光谱技术结合OSC光谱预处理、PLS-DA建模方法识别柑橘叶片黄龙病具有一定可行性。后续研究可以将叶片中的其他营养元素、其他病害用于实验分析，并与黄龙病病害进行对比分析，并改进预处理方法、波段筛选的方法以及建模方法来进一步提高模型的准确性、稳定性和适用性。