48例D变异型基因背景研究*

丁梦圆 周秀 汤龙海 张辉 李艳 王明元

D变异型通常指D抗原数量表达下调或部分D表位缺失，包括弱D、部分D和Del表型[1]。D变异型的准确鉴定对预测胎母免疫、减少溶血性输血反应具有重要意义。目前，D变异型的基因检测已成为血清学有效的补充手段，但国内人群的D变异型分子背景研究尚不完善。本研究通过对苏州、徐州两地的D变异型标本进行基因检测，进一步明确了该人群的RHD遗传背景。

材料与方法

1 研究对象 收集2020年7月～2021年7月苏州市中心血站和徐州市中心血站血型初筛RHD阴性或弱阳性献血者及两地医院送检的RHD阴性或弱阳性患者标本，经血清学鉴定为D变异型者共48例，均征得知情同意。

2 D变异型确认 对实验室收到的初筛阴性或弱阳性的标本使用另外三种抗-D试剂（两家实验室均使用：D1：TH-28/MS-26，英国Millipore；D2：MS-26，北京金豪；D3：D175-2/D415 1E4，加拿大Dominion）进行抗球蛋白试验（苏州市中心血站使用低离子抗人球蛋白卡，瑞士Biorad；徐州市中心血站使用抗人球蛋白检测试剂盒试管法，上海血液生物），有一种或多种抗-D试剂反应阳性者补做直接抗球蛋白试验，直抗阴性者判定为D变异型。同时对RhCE抗原进行试管法鉴定[抗-C（MS-24），抗-c（MS-33），抗-E（MS-80，MS-258）和抗-e（MS-16，MS-21，MS-63），均来自上海血液生物]，对献血者血浆进行间接抗人球蛋白试管法抗体筛查（抗体筛选细胞，上海血液生物）。

3RHD基因检测 提取D变异型标本的基因组DNA，采用PCR-SSP方法（人类红细胞RHD血型变异体基因分型试剂盒，天津秀鹏）对标本RHD等位基因组成进行初步鉴定。相关试剂和操作参照本实验室已发表文献[2]。对于有疑问或无法鉴定的结果，委托秀鹏生物公司对RHD外显子1-10进行基因测序。

4 抗不同表位的抗-D单克隆抗体试剂测定 对含有新突变位点的标本按上述血清学方法进行抗不同表位的抗-D单克隆抗体试剂（DIAGAST）测定。

结 果

1 D变异型标本血清学检测结果及RhCE抗原分型48例D变异型标本与不同抗-D试剂的反应强度见表1。17例RHD*15在间接抗人球蛋白试验中的强度可从0波动到3+；同样，9例RHD*06.03.01在确认试验中可在阴性到4+之间分布。献血者血浆中1例RHD*06.03.01标本检出抗-D抗体，其余均为抗筛阴性。

RHD等位基因组成与RhCE抗原的对应结果见表2。RHD*15的常见分型为ccEe，占该等位基因组成的70.59%；RHD*06.03.01的常见分型为Ccee，占该等位基因组成的77.78%。

表2 RhCE抗原在不同RHD等位基因中的分布情况

2 D变异型标本基因检测结果 基因分型结果（见表1）中，PCR-SSP方法直接确定RHD等位基因组成的有35例，包括RHD*15、RHD*06.03.01、RHD*15/RHD*01EL.01（推测的基因型）和RHD*01EL.01，其中RHD*15和RHD*06.03.01例数最多，分别有17例（34.69%）和9例（18.37%）。其余13例经RHD测序后确定等位基因组成，其中5例为弱D（RHD*01W.72、RHD*01W.54、RHD*01W.10和RHD*11/RHD*01EL.01（推测的基因型）），4例为部分D（RHD*05.01、RHD*05.04、RHD*05.05和RHD*16.02），1例为RHD*01。另有3例单核苷酸突变的弱D标本，分别为2例RHD*779G和1例509T＞G（GenBank：MZ423199），其中509T＞G为新发现突变（见图1）。

图1 RHD外显子测序发现509T＞G突变

表1 D变异型标本与不同抗-D试剂的反应强度

3 抗不同表位的抗-D单克隆抗体试剂测定实验结果509T＞G突变的标本经多种单抗检测与部分D表型接近，见表3。

表3 抗不同表位的抗-D单克隆抗体试剂测定实验结果

讨 论

目前国内D变异型的检出主要依赖于RhD确认试验[3]，但随之出现的多次确认结果不一致以及确认结果为极弱阳性等问题，仅依靠2～3种抗-D试剂的间接抗人球蛋白试验无法得到确切结果，此时RHD基因检测不失为有效的补充方法。由于RHD基因的分布存在种族和地区的差异[4]，故有必要对本地区的D变异型遗传背景进行调查，以便有针对性地检测和指导输血。

现阶段的研究结果显示弱D15型、部分DⅥ.3型和DEL（K409K）为中国汉族人群常见的D变异型，占90%以上[3]。本研究结果也表明RHD*15和RHD*06.03.01最多，分别占34.69%和18.37%，与广州[5]、石家庄[1]和东北[6]等地献血者的调查结果基本一致。由于DEL被定义为仅能通过吸收放散试验检出，在RhD阴性确认中为阴性结果，故未被纳入本次研究，DEL（K409K）即RHD*01EL.01的阳性率较以往报道低[7]。但仍有3例RHD*01EL.01纯合型和2例RHD*01EL.01杂合型被检出，且3例RHD*01EL.01纯合型标本的血清学结果均为仅北京金豪抗-D出现“±”，ZHANG[6]等曾在45例血清学弱D标本中检出3例RHD*01EL.01；HE[8]等报道32例D变异型标本中等位基因组成为RHD*01EL.01的有8例，通过测序和多重连接依赖性探针扩增（MLPA）推出其中6例为RHD1227A/RHD杂合型，并认为RHD1227G＞A可使正常D基因表达减弱，而携带有RHD1227G＞A的D基因不一定呈现为典型的DEL，因此同一基因在不同状态下可能会表达不止一种表型。同样，本研究在D变异型标本中检出1例RHD阳性标本，经RHD测序确认为RHD*01，推测其在基因表达过程中发生了改变。梁延连[9]等曾报道1例RHD阳性患者在多次输血后产生抗-D抗体，检测后发现其RHDmRNA剪接体存在缺失和突变，这些突变有可能引起了RHD抗原表位的缺失。

易品[10]等曾统计了国内关于RhCE表型的研究，指出RHD阳性和RHD阴性个体分别以CCee和ccee表型最多，占比均超过50%，但并未提及D变异型的RhCE表型分布特点。本研究发现RHD*15的常见分型为ccEe，RHD*06.03.01的常见分型为Ccee，占比均超过70%。YE[11]等对DⅥ型的RhCE分型中，以Ccee居多（23/36）；SANDLER[12]等指出RHD*DEL1与C抗原同时出现的概率在91.5%～100%，而E抗原为0%～38.4%。ARNONI[13]等通过分析不同RhCE表型的红细胞D抗原密度发现，C抗原反向抑制D抗原的现象不仅出现在正常D阳性，还出现在D变异型红细胞中，且对不同D变异型的抑制程度不一致（Partial D DAR1.2 42% vs.Partial D DAR3.1 16%）。M GANN[14]等指出CCee抗原可使D抗原表达减弱，而ccEE抗原可使D抗原表达增强。推测其原因为RHCE的表达直接抑制RHD的转录，或影响RHDmRNA的翻译和翻译后修饰，还可能通过空间位阻使D抗原的表达降低。

此外，本研究还发现了3例单核苷酸突变的弱D标本，其中RHD*779G为已报道突变（GenBank：AHY24798.1），为弱D149型。该突变导致D蛋白第260位组氨酸被替换为精氨酸，由于位于第8次跨膜区，可能影响了D蛋白整合至细胞膜[15]。509T＞G为新发现突变，已提交GenBank（MZ423199）。该突变导致第170位蛋氨酸被替换为精氨酸，多种单克隆抗体结果显示，该新突变标本与部分D表型接近。第170位氨基酸位于RhD前庭，即跨膜蛋白通道的细胞外入口，在DOL-1、DOL-2中突变为苏氨酸，DMI中突变为异亮氨酸，DFR中突变为精氨酸，上述突变均为部分D，且大部分可被免疫产生抗-D[16]。

综上所述，本研究通过对本地区D变异型标本进行基因分型和RhCE抗原分型调查，初步了解了其分布规律。由于D变异型在检测和规避免疫刺激方面较RhD阴性或阳性更为复杂，不同的D变异型在孕妇、受血者和献血者中需要区别对待，因此有必要积累更多资料以便进行孕期监测和输血管理。

致谢：衷心感谢浙江省血液中心输血研究所陈舒老师的指导与帮助！

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