一株克氏原螯虾雷氏普罗威登斯菌的分离鉴定与联合药敏试验

董 靖，张露珊，张国栋，刘永涛，刘绍春，杨移斌，艾晓辉，*

(1.中国水产科学研究院 长江水产研究所，湖北省水产品质量安全工程技术研究中心，湖北 武汉430223； 2.岳阳渔美康生物科技有限公司，湖南 岳阳 414100)

克氏原螯虾()俗称小龙虾，属甲壳纲十足目螯虾科原螯虾属，于20世纪30年代由日本引进至我国，是我国常见的四大淡水养殖虾类之一。克氏原螯虾因肉质鲜美、营养成分丰富、生长快、适应能力强等特点深受国内外食客青睐，中国也成为世界最大的克氏原螯虾生产和消费国。克氏原螯虾养殖也因此成为近年来具有发展前景的养殖品种。但近年来随着克氏原螯虾养殖规模的不断扩大，种质退化、养殖标准化程度低、疾病频发、质量安全等因素制约了克氏原螯虾的健康养殖。其中，进入收获季节前后发生的传染性疾病是克氏原螯虾健康养殖的主要威胁。5月初至6月初，克氏原螯虾疾病暴发面积大，死亡量大，损失严重，因此又称为“五月瘟”。为了控制病原菌感染导致的各种疾病，使用了大量的化学抗菌药物，给克氏原螯虾的质量安全带来隐患。

雷氏普罗威登斯菌()是一种革兰氏阴性菌，隶属于肠杆菌科普罗威登斯菌属，能导致多种动物发病。此外，该菌是人类的一种致病菌，能引起腹泻、肺炎和尿道炎等疾病，是一种能通过污染的食品而造成传播的人兽共患病原菌。因此，2006年国家卫生健康委员会将该菌列为人间传染的病原微生物名录。雷氏普罗威登斯菌能导致水产养殖动物如巴西龟()、对虾()、罗非鱼()、鲢()等发病。疫苗和抗菌药物是治疗细菌性感染的主要手段，目前雷氏普罗威登斯菌病的治疗主要依赖化学抗菌药物。尽管抗菌药物对水产养殖的健康发展起到了积极作用，但药物的不合理使用极易导致病原菌耐药性的产生，且在水体中使用抗菌药物可能对生态环境造成一定程度的污染。

近年来，克氏原螯虾收获季节的暴发性疾病日益严重，给养殖业带来了严重的损失，因此亟待探明克氏原螯虾“五月瘟”的成因，提出科学合理的防控方案。2019年5月湖北省潜江市某克氏原螯虾养殖基地发生“五月瘟”，发病克氏原螯虾表现为活力和采食量下降、死亡情况严重。剖检发现患病虾的肝胰腺颜色较浅，有部分患病虾肝胰腺发白，有积液；肠道内容物较健康克氏原螯虾下降明显，严重者肠道有肿胀。经过病原学检查发现，该病原菌为雷氏普罗威登斯菌；通过回归感染试验验证了其对养殖克氏原螯虾的致病力；进一步通过药敏试验分析了该分离株对抗菌药物的敏感性以及抗菌药物与天然化合物的协同抑菌作用；本文为克氏原螯虾“五月瘟”的病因分析、新药研发和科学防控提供了技术支撑和思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病虾样品采集于潜江市某克氏原螯虾养殖基地；健康克氏原螯虾，体重(30±2)g，为本实验室养殖；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；PCR Master Mix、细菌基因组提取试剂盒等分子生物学试剂购自北京天根生化公司；脑心浸液培养基、MH培养基购自青岛海博生物有限公司，天然化合物购自成都曼思特公司。

1.2 细菌分离和纯化

取症状明显的克氏原螯虾在无菌条件下反复冲洗体表3～5次，无菌剖取病虾的肝胰腺。将肝胰腺用0.9%无菌NaCl溶液冲洗3～5次后置于组织研磨器中研磨均匀。用接种棒蘸取研磨液在脑心浸液(BHI)固体培养基上划线，然后将平板置于28 ℃培养箱中静置培养16～20 h。从平板中挑取单菌落继续在平板划线2～3次将细菌进行纯化，纯化后的细菌制作甘油菌后保存于-20 ℃，标记为L20190509。

1.3 分离株毒力试验

挑取分离株L20190509的单菌落至BHI液体培养基中，在28 ℃条件下振荡培养到对数生长中期。使用麦氏比浊法将菌液稀释为1.5×10、1.5×10、1.5×10、1.5×10、1.5×10CFU·mL5个浓度梯度备用。从基地选取健康情况良好的克氏原螯虾180尾，随机分为6个试验组，每组30尾。5个菌悬液试验组在第2和第3腹节处注射菌液100 μL，阴性对照组在相同位置注射0.9%无菌NaCl溶液100 μL。将感染后的克氏原螯虾暂养于玻璃缸内，水温维持在23～25 ℃，溶氧5.5～7.5 mg·L。感染后每24 h观察不同组别克氏原螯虾的临床表现、摄食、活动情况，记录死亡数，连续观察8 d。无菌采取濒死克氏原螯虾的肝胰腺，按1.2节描述的方法分离病原菌并进行鉴定，将得到的死亡数据采用Bliss法计算半数致死浓度(LC)。

1.4 生理生化鉴定

取纯化的分离株单菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察细菌的形态特征。此外，从平板上挑取单菌落用0.9%无菌NaCl溶液稀释至合适浓度后加入到API20E生化鉴定条中，将按说明书处理好的鉴定条放置于28 ℃培养箱中培养24 h后置于ATB 32GN细菌鉴定系统中进行生化鉴定。

1.5 细菌分子鉴定

按天根公司提供的基因组提取试剂盒说明书提取分离株L20190509的基因组，并以此基因组为模板扩增菌株的16S rRNA片段，鉴定采用的通用引物序列为：上游引物(16S rRNA-F)：5′-AGAGTTTGATCATGGCTC-3′，下游引物(16S rRNA-R)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增后将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶检测，扩增产物约为1 500 bp，将目的条带切割回收后进行序列测定。将序列测定结果上传至BLAST软件进行序列同源性比对，选取同源性较高的已知物种序列与L20190509菌株的16S rRNA序列采用MEGA5.1软件构建进化树，方法为邻接法，校正模型为Kimura 2-parameter，通过Bootstraps法自举数集1 000次。

1.6 药敏试验

采用制片扩散法研究L20190509菌株对常用抗菌药物的敏感性。取分离株L20190509菌株的单菌落至BHI液体培养基中，28 ℃恒温振荡培养至对数生长中期。将离心收集的菌体用无菌PBS洗涤3次后重悬至浓度为1.5×10CFU·mL。将菌液均匀的涂布于MH琼脂培养基上，然后将药敏纸片贴于涂满菌液的平板上，28 ℃继续培养16～18 h后用游标卡尺测量抗菌药物的抑菌圈直径，每种药物重复3次。结果判定参照杭州微生物试剂有限公司提供的标准。

1.7 联合抑菌试验

选取氟苯尼考与10种天然化合物，根据CLSI公布的标准方法测定不同组合对分离株L20190509的抑制作用。将氟苯尼考和天然化合物分别用MH培养基在无菌离心管中倍比稀释，然后取50 μL的氟苯尼考和天然化合物分别加入到96孔细胞培养板中，使氟苯尼考浓度从第2到10孔(从左到右，64 μg·mL至0.25 μg·mL)依次降低，天然化合物浓度从B到H孔(从上到下，512 μg·mL至8 μg·mL)依次降低。按1.6节方法制备的菌液用MH培养基稀释至5×10CFU·mL，取100 μL菌液加到96孔板中，分别设置阴性和阳性对照，在28 ℃继续培养18～24 h后观察结果，记录氟苯尼考和天然化合物单独使用和联合使用以后的最小抑菌浓度(MIC)。采用抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)评价联合使用后的抑菌作用， FICI计算公式为FICI=MIC/MIC+MIC/MIC。当FICI≤0.5时为协同作用(synergism，SYN)；0.54时为拮抗作用(antagonism，ANT)。

2 结果与分析

2.1 分离株的培养特性

从肝胰腺分离到的优势菌株在固体培养基上形成圆形、边缘整齐、透明或半透明的隆起光滑菌落。哥伦比亚血琼脂培养基上该分离株无溶血现象，经革兰氏染色后镜检发现该菌株为革兰氏阴性短杆菌。

2.2 回归感染试验

健康克氏原螯虾经注射感染L20190509菌株后出现了不同程度的症状和死亡，其中高浓度剂量组的克氏原螯虾出现了急性死亡，阴性对照组在整个攻毒试验过程中未出现明显的症状，也没有任何死亡情况发生，结果见表1。健康克氏原螯虾感染后出现了活动力下降、反应迟缓等症状。剖检发现，感染克氏原螯虾肝胰腺颜色变浅甚至发白，肠道内容物减少，肠道有充血和肿胀。从濒死的克氏原螯虾肝胰腺中分离到了病原菌，其生长性状与L20190509一致。经Bliss法计算得到L20190509菌株对克氏原螯虾的LC为9.27×10CFU·mL。

2.3 生化鉴定结果

将分离株L20190509单菌落重悬后接种于API 20E生化鉴定条，在28 ℃继续培养24 h后ATB细菌自动鉴定系统中鉴定。结果发现，该分离株的生化特征符合雷氏普罗威登斯菌的特征，与系统中的数据相似度大于98%。生化鉴定结果如表2所示。

2.4 16S rRNA序列分析

通过PCR扩增得到了分离株L20190509的16S rRNA片段，长度约为1 500 bp，PCR产物经纯化后直接测序。将得到的序列与GenBank数据库中的已知序列比对后构建系统发育树。结果如图1所示，分离株L20190509与普罗威登斯菌属BAB-5310(KT254645.1)和雷氏普罗威登斯菌RB151(CP017671.1)聚为一支，同源性为99%。结合该菌株的生理生化特征和系统发育将该菌株判定为雷氏普罗威登斯菌。

表1 L20190509菌株感染健康克氏原螯虾后的死亡率

表2 分离株L20190509的生化鉴定结果

图1 L20190509菌株的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA genes sequence of L20190509

2.5 药敏试验结果

通过纸片扩散法测定了分离株对20种化学抗菌药物的敏感性。从表3可见，L20190509分离株对亚胺培南、头孢噻肟、恩诺沙星3种药物敏感，对氟苯尼考和多西环素2种药物中度敏感，对庆大霉素、妥布霉素、新霉素等15种药物耐药。

表3 L20190509分离株对20种抗菌药物敏感性

2.6 体外联合抑菌作用

从表4可见，氟苯尼考、厚朴酚单独使用的MIC分别为16 μg·mL和64 ·mL，当二者联合使用后其MIC分别为2 μg·mL和 16 μg·mL，经过计算其FICI指数为0.375。氟苯尼考与厚朴酚联用后对L20190509菌株的生长具有协同抑制作用。

3 讨论

近年来随着克氏原螯虾人工养殖规模的不断扩大，各种疾病所带来的损失也越来越严重。但由于对克氏原螯虾疾病的系统研究资料较少，因此，缺乏较为系统有效的病害防控措施。克氏原螯虾传染性疾病的主要病原包括细菌、病毒和寄生虫等。5月是一年中水温迅速升高的季节，同时也是水温波动较大的月份，给克氏原螯虾带来强烈的应激反应；而随着水温的升高导致水体中产生缺氧，亚硝酸盐和氨氮等有害物质的积累。此外，各种病原体液伴随着水温的升高而迅速繁殖，导致感染风险的提高。以上因素是“五月瘟”发生的主要原因。

表4 天然化合物与氟苯尼考(单独或联合)对L20190509菌株的最小抑菌浓度

Thune等通过分析的美国克氏原螯虾感染病例发现，6例疾病发生的温度为28 ℃甚至更高，而仅有2例发生疾病的温度为23 ℃。程慧俊研究了2013年5—10月潜江8个养虾稻田的水体特征发现，5月份平均水温为(30.2±0.44)℃；而王天神等发现，克氏原螯虾在20 ℃左右时其相关免疫因子指标较好，具有较强的抗病力，而当温度在30 ℃时各种酶活力与20～25 ℃时相比显著下降。综合以上研究内容可以发现，5月份以后随着温度的上升，水体中的溶解氧下降，克氏原螯虾的抗病力也随之下降，较容易造成条件性致病菌入侵机体，造成各种感染。因此，克氏原螯虾养殖后期应提高养殖水体的含氧量，适当提高水体高度，减少克氏原螯虾因溶解氧不足和水体温度升高而产生的应激，从而减少病原体入侵的几率。本试验中雷氏普罗威登斯菌感染克氏原螯虾发生于5月份，是“五月瘟”的暴发季节。因此，推断该菌是克氏原螯虾“五月瘟”的病原菌之一。

细菌性疾病常被认为是由于养殖环境恶化而导致的疾病，病原菌以条件性致病菌为主。彭博文等从患病克氏原螯虾体内分离到一株病原菌，经过鉴定为维氏气单胞菌，该菌能够引起克氏原螯虾摄食下降、行动迟缓和暴发性死亡。张立强等发现，异常嗜糖气单胞菌能感染克氏原螯虾并导致其死亡。肖宁等从安徽省人工养殖的患病克氏原螯虾体内分离到一株弗氏柠檬酸杆菌，通过回归感染试验发现该菌株对克氏原螯虾具有较强的致病力，进一步通过粘附试验发现该菌株通过粘附于细胞表面导致EPC细胞病变。以上研究表明，淡水养殖水体中普遍存在的条件性致病菌能感染克氏原螯虾并导致其出现症状甚至大量死亡。克氏原螯虾细菌性感染一般发生于4—6月，是克氏原螯虾大量捕捞上市的季节，一旦发生细菌感染会给养殖者造成严重的经济损失。

普罗威登斯菌属是肠杆菌科细菌，是人肠道的正常菌群之一，是一种食物伴侣菌，极易在食品加工、运输和销售过程中导致动物和人的肠道感染或食物中毒。雷氏普罗维登斯菌能导致多种动物的感染性疾病。曹瑞勇等发现，雷氏普罗威登斯菌能感染黑山羊，导致黑山羊出现流涕、打喷嚏等症状。唐海波等从竹鼠体内分离到一株病原菌，经过鉴定发现该致病菌属于雷氏普罗威登斯菌，能导致感染的竹鼠和小鼠模型出现死亡，对竹鼠具有较强的致病力。此外，雷氏普罗威登斯菌还能引起仔猪、扬子鳄等动物的感染，导致受感染动物出现不同程度的症状甚至大规模死亡。但该菌对水产养殖动物的感染报道较少。张振国等为了分析养殖牙鲆幼鱼的死亡原因，从濒死牙鲆体内分离到了雷氏普罗威登斯菌，发现其能导致牙鲆的死亡，当该菌与迟缓爱德华菌共感染时会引起牙鲆的大量死亡。陈永林等从海洋馆死亡的白鳍鲨的腹腔脓液和心血中分离到了雷氏普罗威登斯菌，通过毒力试验发现该菌能导致受感染的小鼠出现死亡。战文斌等从患败血病的对虾体内分离到3株病原菌，经生理生化鉴定为雷氏普罗威登斯菌，该菌能够导致中国对虾的严重死亡。此外，雷氏普罗威登斯菌能感染中华鳖、巴西龟等动物。以上研究表明，雷氏普罗威登斯菌可感染的动物种类广泛，对哺乳类、爬行类、鱼类、甲壳类动物等均具有较强的致病力。

此外，本试验分析了分离株L20190509对20种抗菌药物的敏感性，发现该菌株对大部分受试药物均不敏感，由此推断该菌耐药性较强。该结果与以往报道的水产动物雷氏普罗威登斯菌的敏感性有所不同，推测与不同地区用药习惯密切相关。为了降低耐药药物的MIC，通过棋盘法研究了氟苯尼考与天然化合物联用的效果。尽管联用后氟苯尼考和大部分天然化合物的MIC均有不同程度的降低，但仅厚朴酚与氟苯尼考联用后其各自MIC值分别降低了4倍和8倍，其FICI值低于0.5，表现出协同抑菌作用。但该试验方法具有一定的菌株特异性，在其他菌株中是否具有类似的协同作用，需扩大菌株样本后进一步试验。以上研究报道了克氏原螯虾雷氏普罗威登斯菌的分离鉴定和药物敏感性，为分析克氏原螯虾“五月瘟”病原和指导水产动物疾病防控提供依据，为今后以本试验菌株为研究对象，探明雷氏普罗威登斯菌的致病机制和感染后克氏原螯虾的主要病理变化；筛选对雷氏普罗威登斯菌有联合抑菌作用的药物奠定了基础。