隐绿原酸对H9N2-AIV致小鼠肺损伤的免疫调节和抗氧化效果

张 昕，张 铭，何宏轩，胡延春，*

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130； 2.中国科学院 动物研究所，北京 100101)

近年来，动物源性的流感病毒不断突破物种屏障感染人类，成为威胁人类健康的重要因素之一。H9N2亚型AIV病毒最早于1966年从北美火鸡体内分离，我国广东省于1994年首次分离鉴定得到该毒株，并在家禽中建立了稳定的种系。近年来研究表明，由于H9N2持续在家禽中广泛暴发流行并变异，增加了与其他亚型流感病毒重组的机会，扩大了宿主范围，使其具备了感染哺乳动物的能力，且能够不通过其他宿主而直接感染人类。H9N2亚型流感病毒是引起禽类发病的主要亚型之一。禽流感主要侵害动物的呼吸系统、消化系统及神经系统等，可从无症状或温和症状到高度致死性的感染。虽然H9N2属于低致病性禽流感，但可引起免疫抑制以及后续继发感染，如鸡群的产蛋率下降、生长缓慢甚至低死亡率，对养禽业造成了巨大的经济损失。由于其能直接感染人类，所以极有可能成为下一个流感暴发的候选毒株之一。

由于大多数天然多酚类化合物具有很强的抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫调节等特性，其在防治炎症性疾病方面发挥着重要的作用，特别是其中几种不同的咖啡酸奎宁酸，如绿原酸(3-caffeoylquinic acid， 3-CQA)、隐绿原酸(4-O-caffeoylquinic acid， 4-CQA)、新绿原酸(5-caffeoylquinic acid， 5-CQA)。以往的药理研究表明，绿原酸具有抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫调节、抗菌的作用，而4-CQA是绿原酸的异构体，在炎症性疾病中的效应作用以及机制尚未明确。因此，本试验采用4-CQA干预被H9N2-AIV感染的小鼠，初步探讨4-CQA对机体免疫调节和抗氧化作用，为隐绿原酸作为病毒性肺损伤疾病的潜在治疗药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株

本试验中所用禽流感病毒是A/sparrow/Shanghai/09/2013(H9N2)株，红细胞凝集价(HA)为2，鸡胚半数致死量(EID)为10/0.1 mL，由本实验室经SPF鸡胚传代扩增并保存。

1.1.2 试验动物

90只6～8周龄SPF级昆明系小鼠(体重10～15 g)，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。小鼠自由采食、饮水、自然光照、室温饲养。

1.1.3 主要试剂

隐绿原酸(纯度≥98.6%)购自成都德思特生物技术有限公司，小鼠抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体购自BD Pharmingen，总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒、髓过氧化物酶(MPO)测试盒均购自南京建成生物工程研究所，改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组

将健康的SPF级昆明系小鼠随机分成H9N2组、H9N2+4-CQA组、空白对照组、4-CQA组四组。分别为H9N2亚型禽流感病毒模型组18只，H9N2亚型禽流感病毒滴鼻后灌胃4-CQA混悬液制剂组36只，健康小鼠空白对照组18只，4-CQA混悬液制剂灌胃对照组18只。

1.2.2 4-CQA混悬液的制备

将100 mg隐绿原酸用RPMI1640培养基定容到10 mL，配制成10 mg·mL的混悬液，充分混匀后用于小鼠的灌胃。

1.2.3 小鼠的处理

将4组小鼠在同等隔离条件下饲养3 d适应环境。于第4天对H9N2组、H9N2+4-CQA组两组小鼠进行H9N2亚型禽流感病毒尿囊液(1×10EID)滴鼻攻毒，每只50 μL；空白对照组、4-CQA组两组滴鼻等量无菌尿囊液。于攻毒2 h后对H9N2+4-CQA组、4-CQA组两组进行隐绿原酸混悬液制剂的灌胃(100 mg·kg)；H9N2组、空白对照组两组灌胃等量的PBS溶液，连续7 d。于灌胃开始后第3、5、7天对H9N2组、空白对照组、4-CQA组3组每组每次随机抽取6只小鼠进行采样，H9N2+4-CQA组每次随机抽取12只小鼠进行采样。

1.2.4 样品采集及处理

实验结束后，每组随机挑选出的小鼠在无菌环境下进行眼球摘除采血。采血后断颈处死，并迅速分离出肺、脾，小鼠左肺浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定1周后进行病理切片检测，右肺迅速放入液氮中快速冷却后存放于-80 ℃冰箱中以备后续使用，脾浸泡于4 ℃ PBS中用于细胞流式检测。

1.2.5 脏器指数测定

无菌条件剖解小鼠后，立即取肺和脾放入0.9% NaCl溶液中清洗，用吸水纸吸干表面水分，分析天平称重。按以下公式计算肺指数和脾指数：肺指数(%)=(肺重/小鼠体重)×100；脾指数(%)=(脾重/小鼠体重)×100。

1.2.6 小鼠肺组织病理切片

取小鼠肺用4%的多聚甲醛固定24 h，修整、清洗、常规脱水、浸蜡经石蜡包埋切成5 μm厚的薄片，HE染色，光镜下观察肺组织病理学变化。

1.2.7 小鼠脾T淋巴细胞亚群测定

将脾按常规方法制备10mL脾细胞悬液，采用小鼠抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，按照说明避光染色，用流式细胞仪检测小鼠脾T淋巴细胞亚群数量及比率。

1.2.8 肺T-SOD活性、MDA含量、MPO活性测定

将肺照说明书制备成10%组织匀浆，储备于-20 ℃。小鼠肺T-SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法，MPO活性测定采用酶比色法，严格按照试剂盒说明步骤进行检测。蛋白含量用考马斯亮蓝染色法测定，严格按照试剂盒步骤进行，根据公式算出T-SOD活性、MDA含量和MPO活性。

1.3 试验数据处理

所有数据采用Excel 2010和SPSS 20.0进行统计分析，通过单因素ANOVA进行分析，结果以“平均值±方差”表示。采用Tukey进行<0.05水平的显著性分析，主成分分析用于分析处理间差异和主要贡献因子。

2 结果与分析

2.1 临床症状和剖检变化

H9N2组小鼠大多数在攻毒第3天的时候开始出现不同程度的感染症状，如精神沉郁、食欲下降、活动量减少、呼吸急促并伴随腹式呼吸、被毛杂乱无光泽等；H9N2+4CQA组在第3天左右也出现与H9N2组相似症状，但程度较轻并逐渐好转，在第7天时，与空白对照组无明显差异；空白对照组小鼠健康、活动量正常、被毛光泽无明显临床症状出现；4-CQA组与空白对照组表现相似，无明显症状出现。剖检小鼠发现，H9N2组小鼠肺呈暗红色，有淤血和针尖状出血现象；H9N2+4-CQA组小鼠肺外观也呈暗红色，但较H9N2组颜色较淡，淤血和出血状况也较轻甚至无明显病理症状；空白对照组和4-CQA组小鼠肺外观呈粉红色，无明显组织病理学症状。

2.2 脏器指数变化

H9N2组小鼠感染H9N2亚型AIV后引发肺部炎症，造成肺质量增加，肺指数上升；免疫器官脾萎缩，脾质量下降，脾指数下降。4-CQA干预后，H9N2+4-CQA组肺质量下降减缓，与H9N2组比较数值上在第3天时肺指数无显著性差异，在第5天呈显著性差异，明显降低肺指数；脾质量下降减缓，数值上第3天时脾指数无显著性差异，第5天和第7天呈显著性差异，明显升高脾指数；与空白对照组比较，数值上在第3～7天时肺指数呈显著性差异，第3天和第7天时脾指数无显著性差异，第5天时脾指数呈显著性差异。4-CQA组与空白对照组的肺指数和脾指数数值相近无统计学差异，结果见表1。

2.3 肺组织病理变化

H9N2组小鼠感染H9N2亚型AIV后，肺主要出现肺间质增生，偶见漏出性出血，肺泡腔内大量红细胞出现，大量中性粒细胞、淋巴细胞等浸润，严重时甚至出现脓肿灶、肺泡壁毛细血管扩张充血或淤血等组织病理学现象(图1A-C)；灌胃4-CQA干预后，H9N2+4CQA组小鼠脏肺毛细血管扩张充血或淤血，肺泡隔轻度增生变宽，偶见少量炎性细胞浸润(图1-D-E)，总体肺损伤程度明显轻于H9N2组；空白对照组(图1-G-H)和4-CQA对照组小鼠肺(图1-I-J)未见明显组织病理学变化，结果见图1。

表1 小鼠脏器指数

2.4 脾T淋巴细胞亚群变化

CD4、CD8T淋巴细胞亚群组成了复杂的网络系统对免疫应答进行精细调节，CD4/CD8比值是机体免疫功能网络调控的重要枢纽，调控免疫进行的方向。H9N2组小鼠感染H9N2亚型AIV后脾CD4T淋巴细胞百分比下降，CD8T淋巴细胞百分比上升，但数据上无统计学差异，CD4/CD8比值下降，数值上与空白对照组呈显著性差异(<0.05)。隐绿原酸干预后，CD4T淋巴细胞百分比上升，CD8T淋巴细胞百分比下降，数值上与空白对照组和H9N2组均无统计学差异；CD4/CD8比值上升，数值上与空白对照组无统计学差异，与H9N2组呈显著性差异。4-CQA组CD4T淋巴细胞百分比下降、CD8T淋巴细胞百分比下降但数值上与空白对照组无统计学差异，CD4/CD8比值与CON组相近无统计学差异，结果见表2。表明隐绿原酸能起到调节T细胞亚群，维持免疫平衡，提高免疫力的作用。

2.5 肺匀浆T-SOD活性变化

图1 小鼠肺组织病理学切片(A-J，200×)Fig.1 Pathological changes of lung(A-J，200×)

H9N2组小鼠感染H9N2亚型AIV后肺的T-SOD活性逐渐降低，第5～7天数值上与空白对照组呈显著性差异(<0.05)。隐绿原酸干预后，肺的T-SOD活性降低减缓，在第5天数值上与H9N2组无显著性差异，与空白对照组呈显著性差异(<0.05)，第7天数值上与H9N2组和空白对照组均无显著性差异。4-CQA组肺的T-SOD活性与空白对照组相近无统计学差异，结果见图2。

2.6 肺匀浆MDA含量变化

H9N2组小鼠感染H9N2亚型AIV后肺的MDA含量升高，第5～7天数值上与空白对照组呈显著性差异(<0.05)。隐绿原酸干预后，小鼠肺的MDA含量上升减缓，第5天数值上与H9N2组和空白对照组都呈显著性差异(<0.05)，第7天数值上与H9N2组呈显著性差异，与空白对照组无统计学差异。4-CQA组小鼠肺的MDA含量与空白对照组相近无统计学差异，结果见图3。

表2 第7天各组小鼠脾T淋巴细胞亚群百分比及比值

*，与空白对照组比较差异显著(P<0.05)；#，与攻毒组比较差异显著(P<0.05)。下同。* showed the significant difference compared with that of control (P<0.05)；# showed the significant difference compared with that of H9N2 group (P<0.05). The same as below.图2 小鼠肺T-SOD活性变化Fig.2 Activity of T-SOD in lung of mice

2.7 肺匀浆MPO活性变化

H9N2组小鼠感染H9N2亚型AIV后肺的MPO活性上升，第5～7天数值上与空白对照组呈显著性差异(<0.05)。隐绿原酸干预后，小鼠肺的MPO活性上升减缓，第5 天数值上与空白对照组呈显著性差异(<0.05)，与H9N2组无统计学差异；第7天与空白对照组无统计学差异，与H9N2组呈显著性差异(<0.05)。4-CQA组小鼠肺的MPO活性与空白对照组相近无统计学差异，结果见图4。

图3 小鼠肺MDA含量变化Fig.3 Content of MDA in lung of mice

图4 小鼠肺MPO活性变化Fig.4 Activity of MPO in the lung of mice

3 讨论

酚酸是一类重要的植物多酚类化合物，它们存在于各种植物性食品中，如蔬菜叶、果实和种子，尤其是果皮含量浓度较高。目前，绿原酸是最常见和丰富的酚酸类物质，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、保肝等药理活性。而隐绿原酸是绿原酸的一种特殊异构体，具有相似的结构特征，但隐绿原酸具有的药理活性目前报道较少。本实验室研究发现，恶性入侵有害微毒植物紫茎泽兰中能分离纯化得出隐绿原酸，不仅能用于生物防除，还能用于紫茎泽兰的潜在药物开发利用。

流感病毒介导肺损伤的免疫病理机制复杂，病毒进入肺部感染肺部支气管黏膜和肺泡壁上皮细胞，促使机体发生免疫反应，造成不受控制的肺过度炎症、全身炎症或活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生。因此流感危重患者死亡的主要原因，并非是不受控制的病毒复制造成的细胞损伤，而是免疫病理损伤。有研究表明，过度的免疫应答是造成机体病理损伤的主要原因之一。T淋巴细胞是免疫细胞中一类非常重要的细胞，在机体的细胞免疫中起重要的作用，成熟的T淋巴细胞按CD表型不同可分为CD4T淋巴细胞和CD8T淋巴细胞，其亚群之间的不平衡可以造成机体免疫紊乱。CD4/CD8也是评判机体免疫平衡状态的重要参数之一，同时对疾病的严重程度和预后具有重要意义，当 CD4/CD8比值偏离时表明细胞免疫功能紊乱。H9N2+4-CQA组中CD4T淋巴细胞百分比和CD4/CD8T淋巴细胞比值与H9N2组比较均显著升高，表明灌胃4-CQA混悬液能起到调节T细胞亚群，维持免疫平衡，提高免疫力的作用。

综上，隐绿原酸能有效的提高由H9N2-AIV病毒感染引起的小鼠脾T淋巴细胞亚群CD4/CD8的比值，减轻小鼠肺炎性细胞浸润、肺间质增宽和出血，降低肺的氧化应激水平，从而达到保护小鼠、缓解肺损伤程度的目的。本试验为进一步发掘4-CQA的药理药效作用的研究提供新的理论依据，同时也为新的药物研发提供了新的参考依据。