人上皮性卵巢癌细胞系侧群细胞的肿瘤干细胞样细胞生物学特性及膜蛋白差异表达的鉴定

尹 婕，潘凌亚，温仪萍，黄 虹，曾 靖，李晓莹，韩甜甜，金 滢，李 艳

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 妇产科， 北京 100730)

上皮性卵巢癌是首位致死性妇科肿瘤。反复复发和化疗耐药的产生是临床治疗上皮性卵巢癌所面临的主要困难。实体瘤的肿瘤干细胞样细胞(cancer stem-like cells)为探索肿瘤发生和化疗耐药的机制提供了新的线索。肿瘤干细胞样细胞具有正常干细胞的多数生物学特性[1]，如自我更新能力、诱导肿瘤发生、抑制药物敏感性和凋亡等[2]。

不同实体瘤的干细胞样细胞具有不同的表面标志物。但有一群细胞表面表达一种ABC家族(ATP-binding cassette)膜蛋白ABCG2/BCRP1，能够外泌双苯酰亚胺Hoechst33342染料，从而在流式细胞检测中形成外泌染料侧群(side population, SP)现象，因此又称为SP细胞[3]。SP细胞富含肿瘤干细胞样细胞，在多种组织和细胞系中被发现和证实，如骨髓、皮肤、肺，以及某些恶性肿瘤，包括肺癌、卵巢癌、膀胱癌、脑癌，等等。许多研究证实SP细胞表达干细胞标志物，具有正常干细胞和肿瘤干细胞样细胞生物学特性[4-8]。

目前，尚无明确的特异性的上皮性卵巢癌肿瘤干细胞样细胞表面标记蛋白，运用SP细胞筛选的手段富集卵巢癌肿瘤干细胞样细胞，从而进行相关生物学特性的鉴定。本研究通过流式分选，筛选上皮性卵巢癌细胞系SP细胞，鉴定其肿瘤干细胞样细胞的相关生物学特性，如增殖与分化能力、克隆形成能力、耐药性及小鼠致瘤能力，并运用定量蛋白质组学技术检测SP细胞中差异表达蛋白，为后续筛选和鉴定特异性上皮性卵巢癌干细胞样细胞表面标记蛋白提供分子基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3和A2780(中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所细胞中心)；NOD/SCID小鼠(中国医学科学院医学实验动物研究所)；细胞培养基HG-DMEM培养基(Gibco Invitrogen公司)；Hoechst33342和维拉帕米(Sigma公司)；反转录PCR所需试剂、SILAC所需试剂(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3和A2780采取贴壁培养，置入含10%胎牛血清的HG-DMEM培养基，细胞培养瓶放入5% CO2、37 ℃、95%湿度细胞培养箱中进行培养。

1.2.2 SP细胞分选、募集:参照文献进行SKOV3和A2780细胞SP细胞流式分选[9]。简单来说，将细胞制成1×106/mL单细胞悬液后，进行Hoechst33342染色，染色条件为37 ℃水浴90 min。对照组在染色同时加入50 μmol/L维拉帕米以阻断染料外泌通路。流式分选前加入2 μg/mL PI染色液标记死细胞。用Moflo分选仪进行SP细胞分析及分选。

收集SP细胞进行体外贴壁培养，至对数生长期后再次进行两次或3次分选，分析SP细胞比例变化，直至能够获得稳定比例的SP细胞。

1.2.3 细胞形态学观察和生长曲线绘制:贴壁细胞用胰蛋白酶消化后，制成单细胞悬液铺至培养板内的小玻片上，贴壁培养72 h后，冲洗细胞爬片，甲醛固定后，吉姆萨染色，光学显微镜下观察形态。MTT法测定细胞生长曲线：细胞接种于96孔板内，每孔500个细胞，每天取3孔，加入5 mg/mL MTT 20 μL，细胞裂解后，酶标仪测定540 nm吸光值(A540)，以吸光值为纵坐标，天数为横坐标，绘制生长曲线。

1.2.4 细胞药物敏感实验[10]:采用MTT法测定细胞对卵巢癌一线化疗药物紫杉醇和顺铂的敏感性。并计算药物对细胞的抑制率(inhibition rate) =[(A对照-A实验)/A对照]×100%。将非SP(non-SP, NSP)细胞耐药指数(resistance index, RI)设置为1，SP细胞RI=SP细胞IC50/NSP细胞IC50。

1.2.5 细胞克隆形成能力:运用流式分选技术，将单细胞接种于96孔板内，每孔一个细胞，加入含10%胎牛血清的HG-DMEM 100 μL，置入37 ℃、5% CO2、95%湿度细胞培养箱中培养7～10 d，计算单细胞克隆数和单细胞克隆形成率(单细胞克隆形成率=克隆形成数/96×100%)。实验重复3次。

1.2.6 反转录PCR:运用Trizol提取细胞总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，再进行PCR扩增。扩增基因及引物序列详见表1。

表1 PCR引物序列及扩增循环Table 1 Primer sequences and amplification cycle for PCR

1.2.7 细胞NOD/SCID小鼠致瘤能力观察:选择5周龄、体质量14～16 g雌性NOD/SCID小鼠进行SP细胞致瘤能力检测。SP和NSP细胞制成1×105个细胞(体积为0.2 mL)混悬液，注射于小鼠肩胛骨皮下。观察各组裸鼠状态、肿瘤形成情况。观察终止指标：肉眼可见肿瘤形成。

1.2.8 定量蛋白质组学技术(细胞培养稳定同位素标记)检测差异表达膜蛋白:运用细胞膜蛋白细胞培养稳定同位素标记(stable isotopic labeling by amino acids in cell culture, SILAC)试剂进行本部分实验[11]，同位素标记和细胞膜蛋白提取均参照Invitrogen公司SILAC膜蛋白试剂盒说明书进行。在稳定SP细胞比例的SKOV3和A2780细胞培养基中掺入普通轻型赖氨酸或[U-13C6]重型赖氨酸，细胞培养传6代后进行SP细胞分选，筛选出含[U-13C6]重型赖氨酸的SP细胞和含轻型赖氨酸的NSP细胞。1∶1比例混合两种细胞后，提取细胞膜蛋白，测定蛋白浓度，进行蛋白质电泳分离、酶切和质谱分析鉴定[12]，测算含重型(H)氨基酸和含轻型(L)氨基酸的肽段强度比值(H/L值)，分析细胞内显著高表达和低表达蛋白。差异表达判断标准：分选重型赖氨酸(H)标记的SP细胞和天然轻型赖氨酸(L)标记的NSP细胞，若H/L比值大于1，蛋白表达上调；若H/L比值小于1，蛋白表达下调。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行数据统计，连续性数值均值比较采用t检验。

2 结果

2.1 成功分选和募集SKOV3和A2780细胞系SP细胞

运用流式细胞分选技术能够成功分选出A2780、SKOV3细胞系SP细胞，首次分选中，SP比例均低于0.5%，二次分选时SKOV3和A2780细胞系SP细胞比例可达5%～6%；A2780 SP细胞在经过3次分选时则最高可达15%(图1)，并且比例稳定在一定水平。

图1 流式分选人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3、A2780 SP细胞Fig 1 SP cells sorting of human epithelial ovarian cancer cell lines SKOV3 and A2780 through flow-cytometry

2.2 SP细胞肿瘤干细胞样细胞生物学特性鉴定

2.2.1 SP和NSP细胞形态观察和生长曲线比较:SP和NSP细胞经过贴壁培养，染色后光学显微镜下观察，形态学差异不显著(图2A)。SP细胞生长显著快于NSP细胞，A2780、SKOV3细胞SP细胞均较NSP细胞较早进入倍增期(图2B)。

图2 SKOV3、A2780 SP和NSP细胞形态学和生长曲线Fig 2 Morphology (A, ×100)and growth curve (B) of SKOV3 and A2780 SP and NSP cells

2.2.2 克隆形成能力:SKOV3和A2780细胞系SP细胞克隆形成率平均值分别为18.75%和39.58%，均显著高于NSP细胞(7.64%和26.39%)(P<0.05)(图3A)。

2.2.3 SP细胞对紫杉醇和顺铂的敏感性差:SKOV3细胞系SP细胞对紫杉醇耐药指数(RI)为2.894±0.582，显著高于NSP细胞(P<0.05)；对顺铂耐药指数为1.402±0.042，同样显著高于NSP细胞(P<0.01)。

A2780细胞系SP细胞同样表现出对紫杉醇和顺铂的耐药性，RI分别为1.422±0.072和1.173±0.038，显著高于NSP(均P<0.01)(图3B)。

2.2.4 SP细胞内其他干细胞相关基因检测:SKOV3细胞SP细胞Oct-4、ABCG2基因表达显著上调，β-catenin基因表达无显著变化；而A2780细胞SP细胞内ABCG2、β-catenin表达显著上调(图3C)。

2.2.5 小鼠致瘤能力检测:SKOV3和A2780细胞系SP细胞在NOD/SCID小鼠体内致瘤能力明显强于NSP细胞。每组细胞接种3只NOD/SCID小鼠，SKOV3 SP细胞NOD/SCID小鼠致瘤时间分别为10、11和15 d，NSP细胞在连续观察2个月内无成瘤。A2780 SP细胞小鼠致瘤时间分别为20、21和18 d，NSP细胞在35 d后才开始成瘤(图3D)。

A.cell clone forming rate=clone forming C.expression of cancer stem-like cells associating genes, including Oct-4, β-catenin and ABCG2; D.xenograft ability of SP and NSP cells in NOD/SCID mice;scale bar=5 mm;*P<0.05, **P<0.01 compared with NSP group图3 SP细胞肿瘤干细胞样生物学特性鉴定Fig 3 Validation of tumor stemness biological characteristics of SP cells

2.3 SP细胞内显著差异表达膜蛋白的检测

SKOV3和A2780细胞内表达差异蛋白质共1 561个和1 989个，其中SKOV3细胞SP细胞中表达上调的蛋白质有920个，表达下调的蛋白质627个。SKOV3 SP细胞内H/L比值≥5的蛋白质有34种，为显著高表达蛋白质，其中12种蛋白质同时在A2780 SP细胞内高表达，包括CD59、TMEM30a等细胞表面膜蛋白；H/L≤0.3的蛋白质有35个，为SP细胞内显著表达下调的蛋白，其中13种蛋白质在A2780 SP细胞内的表达也下调(表1，2)。

表1 SKOV3、A2780细胞系SP细胞膜蛋白表达显著上调的蛋白质Table 1 Up-regulated expressed membrane proteins in both SKOV3 and A2780 SP cell lines

表2 SKOV3、A2780细胞系SP细胞表面膜蛋白表达显著下调的蛋白质Table 2 Down-regulated expressed membrane proteins in both SKOV3 and A2780 SP cell lines

3 讨论

目前有许多研究从寻找和探索上皮性卵巢癌干细胞样细胞角度出发，研究卵巢癌的发生、发展、转移、耐药和复发的机制。多数学者从细胞的克隆形成能力、致瘤能力、分化能力等目前定义肿瘤干细胞的主要标准来鉴定卵巢癌肿瘤干细胞样细胞的存在[13]。体外实验证实，极少量卵巢癌细胞能够在体外形成克隆球， 这是肿瘤干细胞样细胞的重要特性[14]。此外,从卵巢癌患者的腹水中分离得到肿瘤细胞能够在裸鼠体内形成具有与来源肿瘤相似组织病理类型的肿瘤组织，并且表达干细胞相关表面标志物CD117[15]。小鼠卵巢癌SP细胞在小鼠模型中具有更强的肿瘤形成能力[4]。

本研究体外实验验证了卵巢癌细胞系SKOV3和A2780的SP细胞具有肿瘤干细胞样细胞特性，如细胞增殖与分化能力、单细胞克隆形成能力、耐药性和更强的小鼠致瘤能力。这个结论和既往研究[9]一致。SP细胞分选条件较高，且缺乏特异性的标志物，目前尚无法分选出纯度较高的卵巢癌肿瘤干细胞样细胞[16]。

SILAC是一种新的定量蛋白质组学技术，其基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记必须氨基酸取代细胞培养基中相应的氨基酸，细胞经过5～6个倍增周期的培养后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸[11]。不同标记细胞的蛋白质等比例混合，经过分离、纯化后进行质谱鉴定[17]。本试验选择的赖氨酸为标记氨基酸，对细胞生长基本无影响，且标记效率高，检测过程中蛋白质流失少，适合于检测微量蛋白质的表达。因SP细胞比例较低，分选困难，所以本实验选择SILAC进行SP细胞差异蛋白质检测[18]。

本研究运用SILAC技术检测出上皮性卵巢癌SP细胞中2 000多个差异表达蛋白，检测丰度高，并结合两种细胞系，筛选出12种蛋白分子同时在SKOV3和A2780细胞系SP细胞内高表达，基本为膜蛋白，但大多数为细胞内的膜蛋白，细胞表面膜蛋白种类较少，其中包括TMEM109、CD59、TMEM30a、ATAD3A、ATAD3B等，目前尚无研究证实这几种蛋白质在卵巢癌发生、发展、转移、耐药方面的生物学特性。此外，除高表达蛋白质外，还在两种细胞系中检测出13种蛋白质表达下调。后续继续筛选上皮性卵巢癌肿瘤干细胞样细胞表面标志物，可能需从SP细胞表达上调膜蛋白着手，进行筛选和鉴定。

本实验的主要局限性在于缺乏原代上皮性卵巢癌细胞的鉴定，但作为前期实验，本实验为探索上皮性卵巢癌肿瘤干细胞样细胞表面标记蛋白后续深入研究提供了一定的分子基础。