RNA结合蛋白PCBP1通过影响mRNA核质穿梭调控hESC多能性

徐嘉悦，杨嘉宾，陈仲扬，余 佳，马艳妮

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室, 北京 100005)

千百年来，人类胚胎发育一直是大家重点关注的话题，随着科学技术的发展，人们能够将囊胚期具有多能性和自我更新能力的内细胞团人胚胎干细胞(human embryonic stem cell, hESC)分离出来并进行体外培养[1]，探究hESC维持多能性和自我更新能力的基因表达调控机制可以使其更广泛快速地应用于临床治疗，促进人类健康事业的发展。

RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)是一类可以与RNA分子结合的蛋白，近年来对RNA结合蛋白质实验方法层出不穷，揭示了大量的经典和非经典RBP[2-3]。这些RBP的功能复杂，在转录后的RNA代谢过程中发挥着重要的调控功能，其中mRNA核质定位运输是哺乳动物转录后水平调节基因表达潜在的重要节点[3]。

RNA结合蛋白多聚胞嘧啶结合蛋白1[poly(rC) binding protein 1，PCBP1]是一种穿梭蛋白，可通过在细胞核中结合pre-mRNA或ssDNA从而调节转录、选择性剪接过程，及在细胞质中结合mRNA参与翻译调控过程，以促进或抑制基因的表达[4]。本研究旨在探究PCBP1在hESC维持自我更新中的生物学功能，探讨其在RNA核质运输过程中的新机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞: hESC为H1细胞系(北京协和医学院血液学研究所赠送)

1.1.2 主要试剂: 构建质粒所需的内切酶(NEB公司)； Matrigel、mTESR1、ReLeSR和Accutase(Stem Cell公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒(Millipore公司)；核质分离试剂盒(Thermo Fisher Scientificals公司)；Trizol、反转录酶及反转录试剂盒(Invitrogen公司)；RT-qPCR试剂(TaKaRa公司)；PCBP1一抗、β-actin一抗(Proteintech公司); 山羊抗兔二抗(上海碧云天生物有限公司)；引物(天一辉远测序公司)。

1.2 方法

1.2.1 培养人胚胎干细胞：提前准备matrigel，将matrigel根据稀释因子稀释后铺至培养皿，4 ℃放置过夜后进行H1 hESC的培养。细胞会呈现克隆状增殖，大约3～5 d按1∶6的比例进行传代：用37 ℃的PBS清洗细胞，用ReLeSR消化hESC。加入培养基mTESR1重悬克隆，传代至6孔板中进行培养。冻存：与传代消化方法一致，用F12培养基重悬并进行1 000 r/min离心，用mFresR冻存液进行冻存。收细胞进行细胞实验时用accutase进行消化收集。

1.2.2 构建PCBP1的 shRNA载体：在NCBI网站找到PCBP1 mRNA序列，在专业设计网站上设计1条特异性结合PCBP1 mRNA的shRNA序列，在shRNA序列两端加入EcoR1/Age1酶切位点的黏性末端序列，合成的两条shRNA单链片段95 ℃高温退火，得到的双链片段与已切好的pLKO.1载体连接，转化后挑菌提质粒，进行病毒包装。

1.2.3 包装慢病毒：用人胚胎肾细胞HEK293包装病毒，取6 μg目的质粒，4.5 μg PXPAX2和1.5 μg PMD2G包装质粒用opt-mem无血清培养基预混，加入12 μL包装试剂neofect 混匀后室温反应30 min，滴入293T细胞中，4 ～ 6 h换培养基，48 h后收病毒。

1.2.4 hESC碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)染色：6孔板每孔1×103个单细胞，培养7 d，使用试剂盒进行染色。

1.2.5 Western blot 检测蛋白质表达情况:提取细胞总蛋白后进行蛋白定量，高温变性后取等量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳, 电转2 h,室温封闭0.5～1 h，一抗4 ℃孵育过夜。用TBST洗膜30 min，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜后用化学发光显影仪显影。

1.2.6 分离细胞核和细胞质：收取20 μL体积的hESC，PBS洗一次后使用核质分离试剂盒分离hESC核质组分。

1.2.7 RNA提取及实时荧光定量PCR(RT-qPCR): 用Trizol提RNA，加入氯仿后剧烈震荡，12 000 r/min离心，沉淀用75%乙醇清洗，晾干后用ddH2O复溶，测浓度。配置反转录体系，检测总体积为20 μL。随后进行qPCR进行 45个循环的扩增。RT-qPCR用到的引物见表1。

表1 RT-qPCR引物Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 抑制内源PCBP1的表达影响了hESC克隆形成能力和多能性

设计一条shRNA在hESC细胞中显著抑制PCBP1的表达， PCBP1 shRNA敲低效率大于50% (图1A)。由于PCBP1在hESC分化过程中表达水平降低，因此检测PCBP1在hESC多能性维持中的功能。一方面，抑制PCBP1的表达导致hESC细胞克隆出现分化和死亡形态，同时进行克隆数量统计发现克隆数量显著减少，碱性磷酸酶染色显示PCBP1蛋白敲低导致细胞分化(P<0.01)(图1B)。另一方面，抑制PCBP1的表达在RNA水平上抑制了多能性标志基因的表达，促进了各胚层分化标志基因的表达 (图1C)。两方面证据体现了敲低PCBP1蛋白抑制了hESC多能性。

A.Western blot was used to detect the knock down efficiency of PCBP1 protein; B.cell clone morphology was observed under microscope and stained with alkaline phosphatase, alkaline phosphatase staining showed the formation of clones and made statistics, *P<0.01 compared with shNC; C.expression changes of pluripotent marker genes (OCT4, SOX2),differentiation marker genes (HAND1, GATA2, Brachyury, GATA3) were detected by qPCR；*P<0.01， **P<0.001 compared with shNC group图1 PCBP1对hESC多能性维持的影响Fig 1 Effect of PCBP1 on the maintenance of hESC n>3)

2.2 PCBP1在hESC中显著调控RNA核质定位

利用在hESC细胞中构建的shRNA抑制PCBP1蛋白表达后分离 hESC细胞核与细胞质，可见对照组和实验组细胞核标志RNA pre-GAPDH和45S rRNA主要定位在细胞核中(P<0.001)，细胞质标志RNA GAPDH和β-actin主要定位在细胞核中(P<0.001)(图2A，B)，在核质分离成功的情况下，提取各细胞组分的RNA进行RNA测序。获得结果后进行数据标准化，计算RNA核质信号分布，发现敲低PCBP1后，有242条RNA核滞留，有1 272条RNA出核促进(图2C)，可见PCBP1显著调控RNA细胞核定位。根据RNA在核质的丰度，将敲低PCBP1之后差异定位的RNA分群并用热图进行展示(图2D), 细胞核内富集的RNA分为3类：1)对照组细胞质中多，敲低组细胞核中多; 2)对照组细胞核中多，敲低组细胞核中更多; 3)对照组没有变化，敲低组细胞核中多。细胞质内富集的RNA分为3类：1)对照组细胞质中多，敲低组细胞质中更多; 2)对照组细胞核中多，敲低组细胞质中多; 3)对照组没有变化，敲低组细胞质中多。

A,B.nuclear marker RNA pre-GAPDH and 45S rRNA were mainly located in the nucleus, while cytoplasmic marker RNA GAPDH and β-actin were mainly located in the cytoplasm, *P<0.01, **P<0.001 compared with cytoplasm; A.quality control of nucleo-cytoplasmic separation in the control group; B.quality control of nucleo-cytoplasmic separation after the knockdown of HNRNPA3; C.nucleo-cytoplasmic distribution of RNA after knockdown PCBP1; D.differentially located RNA clusters were displayed by heat map图2 RNA结合蛋白PCBP1对RNA核质定位的影响Fig 2 Effect of RNA binding protein PCBP1 on nucleoplasmic localization of RNA

2.3 PCBP1调控核定位、细胞质定位的RNA类型

对敲低PCBP1后进行核质分离的RNA-seq数据进一步分析，发现PCBP1敲低后核滞留的RNA中，有182条是蛋白编码基因RNA，有42条是非编码RNA(图3A)。其中非编码RNA主要包含了12种非编码RNA，其中长基因间非编码RNA、加工后的假基因和未进行加工的假基因数量最多(图3B)。在PCBP1敲低后出核促进的RNA中，有1 224条是蛋白编码基因RNA，有48条是非编码RNA(图3C)，其中非编码RNA主要包含了12种非编码RNA，其中长基因间非编码RNA、反义RNA和加工后的假基因数量最多(图3D)。

A.the type and proportion of RNA retained in the nucleus after PCBP1 knockdown; B.the type and proportion of non-coding RNA retained in the nucleus after PCBP1 knockdown; C.the type and proportion of RNA enriched in cytoplasm after PCBP1 knockdown; D.types and proportions of non-coding RNA enriched in cytoplasm after PCBP1 knockdown图3 PCBP1调控核定位、细胞质定位的RNA类型Fig 3 PCBP1 regulates nuclear localization and cytoplasmic localization of RNA types

2.4 PCBP1对胚胎发育相关基因的核质定位的影响

敲低PCBP1后RNA-seq检测到OCT4、SOX2、NANOG多能性mRNA核滞留，分化相关mRNA 只有HAND1出核促进(图4A)，对敲低PCBP1后核质分离的RNA-seq数据进行差异基因的GO富集分析，发现很多早期胚胎发育相关基因mRNA在PCBP1蛋白敲低后出现核滞留，如：生长发育、脊索动物的胚胎发育、细胞形态发生相关调控基因(图4B)。而在PCBP1蛋白敲低后出核促进的mRNA主要参与RNA代谢、核糖核蛋白复杂装配、线粒体运输、蛋白质的定位、mRNA剪接、负调控蛋白修饰等生物学过程(图4C)。

A.changes in the distribution of pluripotency and differentiation related genes after knockdown of PCBP1, *P<0.05 compared with shNC group; B.go enrichment analysis of nuclear stranded RNA after PCBP1 protein knockdown; C.go enrichment analysis of cytoplasmic enriched RNA after PCBP1 protein knockdown图4 核质分布差异基因的GO富集分析Fig 4 A association between hnRNPA3 and the RNA export factors

3 讨论

本研究表明，PCBP1对hESC克隆形成能力及多能性维持有重要的作用，敲低PCBP1蛋白引起hESC分化且克隆形成能力下降。对其进行机制的探索，本文发现一方面，PCBP1通过促进多能性基因OCT4、SOX2mRNA的表达，同时抑制分化标志基因HAND1,GATA2,Brachyury和GATA3mRNA水平的表达来维持hESC存活及自我更新能力；另一方面，PCBP1通过调控胚胎发育及干细胞分化相关基因的核质运输来维持hESC多能性，抑制PCBP1内源性表达后多能性mRNA出核受阻，许多胚胎发育及干细胞分化相关基因mRNA均滞留在细胞核内，只有分化相关mRNAHAND1出核促进。在已知报道中PCBP1定位于细胞核，PCBP1可能通过调控多能性和分化相关mRNA转录和出核来发挥功能，从而导致hESC存活能力下降，克隆形成能力减弱。另一种可能是PCBP1调控出核和RNA的稳定性，使滞留在细胞核内的多能性mRNA稳定性下降，不能进入细胞质内进行翻译。相似的，在之前的报道中，PCBP1KO鼠在囊胚期(3.5E)、胚胎期(8.5E)及出生一周后幼崽存活率依次降低，PCBP1全身性敲除导致胚胎致死[7-8]， PCBP1可能对人和鼠早期胚胎发育和胚胎干细胞的多能性维持有保守性的功能。

核质分离的RNA-seq数据显示PCBP1主要影响mRNA的核质运输，对非编码RNA的核质定位影响不大，一个可能的原因是ncRNA数量上要远远少于mRNA。PCBP1对于mRNA出核的调控主要表现在抑制细胞核内的mRNA出核，可能参与了这些mRNA在细胞核内的剪接、加工及稳定性的维持，这与先见知识一致[4]。 PCBP1对于mRNA出核的调控的另一个体现在其帮助许多胚胎发育及分化相关基因的mRNA出核到细胞质中进行翻译或者是降解。随着科学技术的进步，人们逐渐发现非编码RNA在基因表达调控过程中也发挥着举足轻重的作用[10-11]， PCBP1也会影响少部分非编码RNA的核质定位。PCBP1在何时何地，以何种方式结合这些潜在功能型非编码RNA仍然值得继续更深入地探索。