益生菌对产气荚膜梭菌感染肉鸡免疫功能和肠道屏障基因表达的影响

夏 亿，孟禹璇，丁斌鹰，王 蕾，赵 迪，郭双双，侯永清

（武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023）

农业部第194号公告表明，自2020年7月1日起，饲料企业停止生产含有抗生素等促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料，随着饲料中抗生素减少，一部分禽畜疾病有增多的趋势，如产气荚膜梭菌感染引起的坏死性肠炎就是其中的一种。产气荚膜梭菌感染因损伤动物肠道，易传染，严重时破坏机体免疫系统引起毒血症，导致动物死亡等特点，给养殖业带来巨大的经济损失。欧盟部分国家数据表明，鸡群感染产气荚膜梭菌后，死亡率上升，发病率为3%～10%，由亚临床症状造成的经济损失占到生产成本的10%。因此，在饲料无抗的背景趋势下提高生产效益成为焦点问题，寻找安全，高效，绿色无污染的抗生素替代物成为当前最重要的任务之一。

益生菌有改善肠道环境，降低肠道有害菌数量，且具备分泌多种消化酶促进肠道消化吸收等有益作用，被认为是良好的抗生素替代品。在益生菌的生理研究过程中，目前研究的重点是调节肠道功能。发酵乳杆菌（，LF）是肠道固有乳酸杆菌之一，主要通过调节Th1/Th2细胞比例发挥对宿主免疫发育及免疫调节的积极作用。凝结芽孢杆菌（，BC）是产乳酸芽孢杆菌，具有较广的抗菌谱，能提高机体细胞免疫、体液免疫水平和抗病能力。前期研究发现饲粮中添加发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌均对产气荚膜梭菌感染肉鸡的肠道微生物具有调控作用，且添加凝结芽孢杆菌一定程度上提高了肉鸡的生长性能，同时有利于肠道绒毛发育。基于前期研究，本试验探究了两种益生菌对感染产气荚膜梭菌的肉鸡免疫和肠道屏障功能的影响，为益生菌在肉鸡生产中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 A型产气荚膜梭菌CVCC2030购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，发酵乳杆菌购自中国普通微生物菌种保藏中心，凝结芽孢杆菌（活菌数为1×10CFU/g）由湖北浩华生物技术有限公司提供。

1.2 试验设计 试验设计以及肉鸡饲养管理与夏亿等的相同，采用单因素试验设计，根据公母各半和体重相近的原则，将336只1日龄爱拔益加肉仔鸡（购自湖北荆州正康家禽公司）随机分成4个处理组，每个处理6个重复，每个重复14只鸡。对照组和感染组肉鸡饲喂玉米-豆粕型基础饲粮，饲粮组成和营养水平见表1。感染+LF组和感染+BC组分别在基础饲粮中添加1×10和1×10CFU/kg的发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌。试验期28 d。

表1 基础日粮组成和营养水平（风干基础）

1.3 产气荚膜梭菌感染 将产气荚膜梭菌接种到含牛肉粒的疱肉培养基中，在37℃培养箱中厌氧培养16 h后，活菌数调整为1×10CFU/mL，疱肉培养基和牛肉粒购于北京奥博星生物技术有限责任公司。参照Du等方法建立产气荚膜梭菌感染模型，所有感染组肉鸡从第14～21日龄连续经口接种A型产气荚膜梭菌新鲜菌液，每只鸡每天接种1 mL。对照组肉鸡灌喂1 mL不含产气荚膜梭菌的肉汤培养基。

1.4 样品采集 于试验第21和28天，从每个重复随机选取公鸡和母鸡各1只，翅下静脉采血，待血清析出后，3 000 r/min离心10 min，取上清分装，于-80℃冰箱保存待测。取十二指肠、空肠、回肠中间部分（长约10 cm），剖开肠段后用预冷的无RNA酶水冲洗肠道内容物，刮取肠黏膜，置于无RNA酶离心管中，液氮速冻后转移至-80℃冰箱中保存待测。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 生长性能的测定 在第28天早上，以重复为单位测定肉鸡空腹体重，记录全期采食量同时观察健康状况，计算肉鸡全期的平均日增重、平均日采食量和耗料增重比。

1.5.2 血清溶菌酶含量的测定 按照溶菌酶检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书的要求，采用比浊法测定血清中溶菌酶含量。

1.5.3 血清免疫球蛋白（IgA和IgG）含量的测定 采用ELISA法定量测定血清中IgA和IgG含量，试剂盒购自美国Bethyl Laboratories公司。向96孔酶标板每孔加入100 μL稀释后的包被抗体，37℃孵育1 h，然后洗涤5次，甩干后每孔加入200 μL阻断液，37℃孵育30 min，洗涤5次，甩干后每孔中加入100 μL标准品或样品，37℃孵育1 h，洗涤5次，甩干后每孔中加入100 μL稀释后的链霉亲和素标记的HRP，37℃孵育1 h，洗涤5次，甩干后每孔中加入100 μL TMB显色液，37℃避光孵育15 min，每孔加入100 μL终止液，用酶标仪（SpectraMax190，Molecular Devices，美国）在450 nm波长下读取吸光值。制作标准曲线，根据吸光值计算血清中IgA和IgG含量。

1.5.4 肠黏膜免疫与屏障基因mRNA相对表达量的检测将十二指肠、空肠和回肠黏膜样品于液氮中研磨，采用RNAiso Plus试剂（TaKaRa，大连）提取各样本的总RNA，RNA的浓度和纯度用Nanodrop进行测定。根 据PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa，大连）的方法，取1 μg RNA进行反转录，合成cDNA。采用SYBRPremix Ex TaqTM试剂盒（TaKaRa，大连）在实时荧光定量PCR仪（ABI 7500，ThermoFisher Scientific，美国）上进行基因表达测定。检测的免疫相关基因包括白介素-4（）、白介素-8（）、肿瘤坏死因子（-）、诱导型一氧化氮合成酶（）、多聚免疫球蛋白受体（）和禽-防御素（AvBD1、、），屏障结构相关基因为闭锁小带蛋白-1（ZO-1）、闭合蛋白（）、连接蛋白-1（）和黏蛋白-2（）。以-为内参基因，以对照组为参照，采用2法计算基因的相对表达量。基因的引物序列见表2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 引物序列

1.6 统计分析 试验数据采用SPSS 21.0统计软件进行分析。对照组和感染组间采用Students′检验进行分析，显著性用a、b表示。感染组、感染+LF组、感染+BC组之间采用单因素方差分析（One-way ANOVA），当差异显著时，采用邓肯氏多重比较进一步分析，显著性用x、y、z表示。以≤0.05为差异显著，以0.05<<0.10为有差异显著的趋势，结果用平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 益生菌对感染肉鸡生长性能的影响 由表3可知，与对照组相比，感染组肉鸡的平均日采食量降低（<0.05），平均日增重和耗料增重比在4个处理组间无显著变化。

表3 益生菌对感染肉鸡生长性能的影响

2.2 益生菌对感染肉鸡血清溶菌酶活性和免疫球蛋白含量的影响 由表4可知，与对照组相比，感染组血清溶菌酶活性没有显著变化，但是有增加第21日龄血清IgA含量的趋势（=0.06），降低了第28日龄血清IgG含量（<0.05）。与感染组相比，添加两种益生菌均降低了第21日龄血清溶菌酶活性和IgA含量（<0.05），感染+BC组降低了第28日龄血清溶菌酶活性（<0.05），但是两种益生菌对第28日龄血清免疫球蛋白水平没有显著影响。

表4 益生菌对感染肉鸡血清溶菌酶活性和免疫球蛋白含量的影响

2.3 益生菌对感染肉鸡肠道免疫基因表达的影响 由表5可知，在第21日龄，与对照组相比，感染组上调了十二指肠、、AvBD1和，空肠和，以及回肠的mRNA表达（<0.05）。与感染组相比，添加两种益生菌下调了空肠以及回肠表达，上调了空肠-表达（<0.05）；感染+LF组上调了空肠和回肠-表达，下调了回肠表达（<0.05）；感染+BC组上调了十二指肠表达，下调了十二指肠和空肠表达（<0.05）。

表5 21日龄肉鸡肠道黏膜免疫基因的相对表达量

由表6可知，在第28日龄，与对照组相比，感染组上调了十二指肠和以及回肠表达（<0.05）。与感染组相比，添加2种益生菌均下调了十二指肠表达，上调了空肠和表达（<0.05）；感染+LF组下调了十二指肠表达，上调了空肠表达（<0.05）；感染+BC组下调了十二指肠-和回肠表达，上调了空肠表达（<0.05）。

表6 28日龄肉鸡肠道黏膜免疫基因的相对表达量

2.4 益生菌对感染肉鸡肠道屏障基因表达的影响 由表7可知，在第21日龄，与对照组相比，感染组上调了十二指肠和空肠ZO-1、和，以及回肠和表达（<0.05）。与感染组相比，添加两种益生菌均下调了十二指肠和以及回肠表达，上调了十二指肠ZO-1表达（<0.05）；感染+BC组上调了空肠和的相对表达量（<0.05）。

表7 21日龄肉鸡肠道紧密连接蛋白和黏蛋白基因的相对表达量

由表8可知，在第28日龄，与对照组相比，感染组上调了十二指肠和空肠表达（<0.05）。与感染组相比，添加两种益生菌均下调了小肠、十二指肠和回肠以及十二指肠的相对表达量（<0.05）；感染+LF组上调了空肠ZO-1表达（<0.05）。

表8 28日龄肉鸡肠道紧密连接蛋白和黏蛋白基因的相对表达量

3 讨 论

3.1 益生菌对感染肉鸡生长性能的影响 产气荚膜梭菌增殖能引起坏死性肠炎，对肉鸡的健康和生产效益造成一定的负面影响，因此本试验拟探究饲粮中添加益生菌能否缓解产气荚膜梭菌感染引起的坏死性肠炎。赵娜等研究表明，饲粮中添加凝结芽孢杆菌能增加肉鸡的平均日增重和平均日采食量。在球虫和产气荚膜梭菌混合感染模型下，肉鸡饲粮中添加400 mg/kg 凝结芽孢杆菌有增加体重的趋势。本试验中，产气荚膜梭菌感染降低了肉鸡的平均日采食量，添加益生菌没有显著缓解采食量的降低，但是感染+BC组的平均日采食量与对照组较为接近。

3.2 益生菌对感染肉鸡血清溶菌酶活性和免疫球蛋白含量的影响 溶菌酶普遍存在于动物机体的多种组织和分泌液中，被认为是反映机体非特异性免疫的重要依据。刘丹报道，产气荚膜梭菌感染后第1天肉鸡血清溶菌酶活性显著降低，感染后第7天溶菌酶活性没有显著变化。Deon等研究表明，饲粮中添加由乳酸杆菌和芽孢杆菌组成的复合益生菌增加了沙门氏菌感染肉鸡的血清溶菌酶活性。本试验中，添加发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌降低了感染肉鸡的血清溶菌酶活性，这可能是由于2种益生菌减少了肠道产气荚膜梭菌数量。血清IgA能以非炎症的形式清除大量抗原，这对维持机体内环境稳态起着关键作用。IgG在家禽体内主要由脾脏和淋巴结内的浆细胞分泌和合成，当机体受到抗原刺激时，与抗原特异性结合的IgG由家禽免疫系统产生，因此机体的免疫能力可通过检测免疫球蛋白IgG含量来体现。申维维等报道，向肉鸡饲粮中添加凝结芽孢杆菌可提高14日龄肉鸡血清中IgG含量。张彩风等发现在饲粮中添加0.1%乳酸菌和酵母菌复合菌剂可以升高21日龄肉仔鸡血清IgG含量。本试验中，产气荚膜梭菌感染降低了28日龄的血清IgG水平，添加益生菌虽然没有显著改变IgG含量，但是益生菌组的IgG水平介于对照组和感染组之间。

3.3 益生菌对感染肉鸡肠道免疫基因表达的影响 IL-4作为抗炎性因子，其表达水平在急性感染和自身免疫中存在差异。孙玉丽等报道，在饲粮中添加葡聚糖可使肉仔鸡在感染产气荚膜梭菌后第14天血清中IL-4含量显著提高。本试验中，饲粮添加发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌上调了28日龄空肠基因的表达。IL-8是具有生物活性的多肽物质，也是机体发生炎症反应中早期的炎症细胞因子。本试验结果显示，产气荚膜梭菌感染上调了第21日龄肉鸡空肠和回肠基因的表达，这与倪学勤等的研究结果相吻合，表明产气荚膜梭菌感染激发了炎症反应，导致促炎性因子基因上调。添加两种益生菌均下调了第21日龄肉鸡空肠基因表达，发酵乳杆菌下调了回肠基因表达，缓解了产气荚膜梭菌感染引起的炎症反应。

iNOS主要存在于巨噬细胞、中性粒细胞等参与免疫反应的细胞中，在细胞受到刺激后以-精氨酸为底物生成大量NO，并利用NO的氧化应激协助巨噬细胞参与免疫反应，从而对抗病原体。王俊峰等研究表明，产气荚膜梭菌感染提高了肉鸡血清iNOS含量。本试验结果表明，产气荚膜梭菌感染上调了第21日龄十二指肠基因表达，饲粮添加发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌下调了第28日龄肉鸡十二指肠基因表达，说明两种益生菌缓解了感染肉鸡的肠道炎症反应。pIgR能介导免疫球蛋白多聚体在上皮细胞中的分泌和转运，使免疫球蛋白在黏膜局部发挥抵抗病原菌的作用。本研究显示，凝结芽孢杆菌上调了感染肉鸡第21日龄十二指肠基因的相对表达量，这表明凝结芽孢杆菌提高了肠道局部免疫力。当机体受到细菌感染，或受到炎症因子、引起天然免疫的细菌因子等刺激时，可诱导防御素表达。Hong研究表明，在艾美耳球虫和产气荚膜梭菌共同感染的情况下，肉鸡空肠和的基因表达显著上调，肠道基因表达无显著差异。张贝贝等发现产气荚膜梭菌感染第21日龄肉仔鸡，饲粮中添加精氨酸显著降低了的mRNA表达量。本试验结果表明，产气荚膜梭菌感染上调了第21日龄肉鸡十二指肠和以及空肠基因相对表达量，而添加凝结芽孢杆菌对这些基因的表达有下调作用，表明凝结芽孢杆菌缓解了产气荚膜梭菌感染导致的炎症反应。

3.4 益生菌对感染肉鸡肠道屏障基因表达的影响Occludin是最先被发现的跨膜紧密连接蛋白，在维持细胞极性中具有重要地位。杜恩存发现饲粮中添加植物精油显著下调了第21日龄肉仔鸡感染球虫后空肠的mRNA表达量。本试验表明，添加发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌普遍下调了小肠基因的相对表达量，但是并未降低肠道形态结构的完整性。肠道上皮细胞间通过多种蛋白和分子形成紧密连接结构，而claudin蛋白可加强紧密连接结构的紧密性。Weber等研究表明，炎症性肠炎中肠道表达增加。本试验也表明产气荚膜梭菌感染普遍上调了肉鸡小肠相对表达量，而饲粮添加发酵乳杆菌或凝结芽孢杆菌下调了肠道相对表达量，这表明益生菌有缓解肠道炎症的作用。在小肠中是主要的黏蛋白基因，在杯状细胞中能编码分泌黏蛋白，产气荚膜梭菌分泌的水解酶可降解黏液糖蛋白，破坏黏液屏障。本研究表明，产气荚膜梭菌感染上调了第21日龄空肠基因相对表达量，这可能是由于感染引起黏液降解，从而刺激黏蛋白基因的表达，促进黏液分泌。添加发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌下调了感染肉鸡肠道的表达，可能是由于益生菌抑制了产气荚膜梭菌增殖，缓解了黏液层损伤。

4 结 论

本试验结果表明，饲粮中添加发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌均能缓解产气荚膜梭菌感染造成的肉鸡炎症反应，调控肠道紧密连接蛋白和黏蛋白基因的表达。