白子菜对2型糖尿病合并急性肾损伤小鼠的保护效应

韦美梦，柳俊辉，李耀华，卢澄生，闫理姣，唐冬伟，梁斐琳，雷梦颖，韦乃球

(广西中医药大学，广西 南宁 530200)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一组因胰岛素绝对或相对分泌不足和(或)胰岛素利用障碍引起的糖脂代谢紊乱性疾病，病程久可导致眼、肾、神经、心脏、血管等组织器官的功能减退及衰竭等[1]。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)为最常见的DM类型，占DM病人的90% 以上[2]。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是DM最常见的微血管并发症，也是临床常见病、多发病[3]。随着DM和DN发病率的增加，T2DM合并急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)的患者也有所增加，尤其是老年患者更易发生[4-5]。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是一种重要的致炎因子，其诱导的脓毒症是AKI的常见诱因[6]。

白子菜Gynuradivaricata(L.)DC.为菊科多年生草本植物，又名白背三七、白仔菜、救命草等[7]；其根味甘、性凉，有清热凉血、散瘀消肿之功效；而茎叶味咸、性凉，有清热、舒筋、接骨、止血、祛痰的作用[8]。近年来，老百姓以白子菜食、药两用，广泛用于治疗胃病、高血压病、高血脂症及糖尿病等。已有文献报道白子菜具有改善胰岛素抵抗、降血糖、降血脂、抗氧化、降血压以及保护高血压引起的主要器官损伤等作用[9-22]。但是，白子菜对(T2DM+AKI)模型小鼠的保护效应尚未有相关研究报道。本实验通过建立(T2DM+AKI)小鼠模型，探讨白子菜对(T2DM+AKI)的保护效应，并从炎症反应角度探讨其初步疗效机制，为开发白子菜药用价值方面提供依据。

1 实验材料

1.1 药物

实验药物采于广西贵港，经广西中医药大学药学院药用植物教研室的郭敏副教授鉴定，为菊科植物白子菜Gynuradivaricata(L.)DC.的全草。

1.2 动物

雄性KM小鼠，体质量(20±2)g，SPF级，购自广西医科大学实验动物中心，许可证号为：SCXK(桂)2014-0002。

1.3 试剂

高糖高脂饲料(由普通饲料69.3%、猪油10%、蔗糖20%、食盐0.5%、胆固醇0.2%组成)，课题组自行配制；链脲佐菌素(STZ)(批号：SO130)，Sigma；盐酸二甲双胍(批号：180906)，上海融禾医药科技有限公司；4%多聚甲醛组织固定液(批号：1810083)，广州赛国生物科技有限公司；TNF-α(批号：20190123)、IL-6(批号：20190116)、ICAM-1(批号：20181220)，bioswamp。备注：血清BUN、Scr采用的是全自动生化检测，全自动生化检测仪检测试剂采用配套的一体化检测试剂包，没有单独的试剂批号。

1.4 仪器

ACCU-CHEK罗氏血糖测试仪，罗氏诊断产品(上海)有限公司；UV-1800紫外可见分光光度仪(日本岛津公司)；DNM-9602全波长酶标仪(北京普朗新技术有限公司)；德国Eppendorf 5430R台式高速冷冻离心机(上海艾研生物科技有限公司)；AB204型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；吉尔森P型移液器(深圳市科力易翔仪器设备有限公司)；Aeroset-2000全自动生化分析仪(美国Instrument laboratory公司)；MDF-U7386S超低温保存箱(日本 SANYO 公司)；电泳仪(美国 BIO-RAD 公司)；全自动化学发光分析仪(上海天能公司)；电子天平(德国Sartorius公司)；BX51T-PHD-J11显微镜(日本奥林巴斯公司)；RM2015切片机(德国莱卡公司)。

2 方法

2.1 白子菜提取物的制备

取白子菜干品1 kg，加10倍量的水，浸泡1 h后回流提取1.5 h，趁热过滤，药渣加8倍量水回流提取1.0 h，趁热过滤，将两次滤液混合并摇匀，浓缩药液，各制成相当生药2 g/mL的浸膏，置4 ℃冰箱备用。

2.2 动物分组、造模及给药

取 90 只SPF级KM小鼠适应性饲养3 d，随机取出 10 只作为正常对照组，其余小鼠随机平均分为T2DM组、(T2DM+AKI)组、(白子菜高、低剂量+T2DM)组、(白子菜高、低剂量+T2DM+AKI)组、(二甲双胍+T2DM)组和(二甲双胍+T2DM+AKI)组。小鼠喂食高糖高脂饲料结合一次性腹腔注射 100 mg/kg 的链脲佐菌素复制T2DM模型，T2DM小鼠腹腔注射 LPS(10 mg/kg)复制(T2DM+AKI)模型。给药组小鼠腹腔注射 LPS前 7 d 开始，用白子菜水煎液灌胃，1次/d，持续 15 d。除正常对照组外，其余各组小鼠全程喂养高脂饲料直至实验结束。

2.3 一般情况观察

观察各组小鼠饮食及大小便、活动状态、精神状况等。

2.4 空腹血糖的测定

在小鼠第15d末次给药后，禁食不禁水12 h，尾尖取血，利用罗氏血糖测试仪测定血糖值。

2.5 血清BUN、Scr含量检测

血液样品在室温放置 2 h 后，于4 ℃ 条件3 000 r·min-1离心 10 min，收集血清按试剂盒说明书测定BUN、Scr的含量。

2.6 ELISA 法检测炎症反应相关因子

取肾组织，放入匀浆管，称量后加入9倍量预冷的生理盐水进行匀浆，匀浆后于4 ℃ 条件3 000 r·min-1离心10 min，并提取上清液按ELISA试剂盒说明书操作检测TNF-α、IL-6和IL-10含量。

2.7 肾组织病理形态学的观察

取肾组织，用预冷生理盐水进行清洗并称量，浸于10%甲醛溶液24 h，脱水石蜡包埋，60 ℃条件下固定1 h，并以二甲苯溶液处理10 min，切片依次以梯度乙醇溶液处理，再以 PBS 洗涤3次，每次5 min。进一步以苏木素染液染色10 min，并用1%盐酸酒精分化；以促蓝液反蓝5 s后加伊红染液染色3 min，再依次用 80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱水，晾干后以中性树胶封片，光镜下观察肾组织形态学改变。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 各组小鼠一般行为学观察

正常对照组小鼠反应灵敏，活动正常，体毛光泽，饮食饮水正常，大便颗粒状，尿淡黄色，垫料干燥，体质量增加。T2DM 组小鼠反应迟钝，倦怠蜷卧或烦躁易怒，体毛枯燥，饮食饮水增多，常有腹泻，尿多，垫料潮湿，体质量减少，(T2DM+AKI)组小鼠上述异常表现更明显。与T2DM组、(T2DM+AKI)组比较，白子菜各剂量组小鼠各项表现趋于正常。

3.2 白子菜对(T2DM+AKI)小鼠空腹血糖的影响

结果如表 1所示，与正常对照组比较，T2DM组、(T2DM+AKI)组小鼠空腹血糖含量显著升高，且(T2DM+AKI)组较T2DM组升高明显。与T2DM组、(T2DM+AKI)组比较，白子菜各剂量组小鼠空腹血糖含量均显著降低。

表1 对小鼠空腹血糖水平的影响

3.3 白子菜对(T2DM+AKI)小鼠肾功能的影响

结果如表 2 所示，与正常对照组比较，T2DM组、(T2DM+AKI)组小鼠血清BUN、Scr 含量均显著增加，且(T2DM+AKI)组较T2DM组增加明显。与T2DM组、(T2DM+AKI)组比较，白子菜各剂量组小鼠血清BUN、Scr含量均显著减少。

表2 对小鼠BUN、Scr含量的影响

3.4 白子菜对(T2DM+AKI)小鼠肾组织 TNF-α，IL-6和IL-10含量的影响

结果如表 3 所示，与正常对照组比较，T2DM组、(T2DM+AKI)组小鼠肾组织TNF-α、IL-6含量明显增加，而IL-10含量明显减少，且(T2DM+AKI)组较T2DM组增加或减少明显。与T2DM组、(T2DM+AKI)组比较，白子菜各剂量组小鼠肾组织TNF-α、IL-6含量明显减少，而IL-10含量明显增加。

表3 对小鼠肾组织TNF-α，IL-6和IL-10含量的影响

3.5 白子菜对(T2DM+AKI)小鼠肾组织病理学的影响

结果如图 1 所示，正常对照组小鼠肾组织结构正常，肾小管结构清晰，肾小球数目较多且大小均匀，形态正常，未见炎性细胞。T2DM组、(T2DM+AKI)组小鼠肾小管明显扩张，肾小球萎缩变形，排列不均匀，数目与正常对照组比较明显减少，可见严重的肾脏损伤，且(T2DM+AKI)组较T2DM组严重。同T2DM组、(T2DM+AKI)组比较，白子菜各剂量组小鼠肾小球结构较清晰，数目也增多，大小形态基本恢复正常，肾小球萎缩现象得到一定程度的缓解。

图1 各组肾脏病理组织(HE，×200)

4 讨论

研究表明，BUN 和 Scr含量增加是AKI的重要标志[23]，而DM或 T2DM和高尿酸血症之间相互影响，即通过降低血尿酸可改善血糖水平[24-25]。但是，目前对(T2DM+AKI)动物模型的研究甚少，本研究通过链脲佐菌素合并腹腔注射LPS的方法复制(T2DM+AKI)小鼠模型。结果表明，与正常对照组比较，T2DM组、(T2DM+AKI)组小鼠肾小球萎缩变形，数目明显减少，可见严重的肾损伤，且(T2DM+AKI)组较T2DM组严重；空腹血糖、血清BUN和Scr含量均明显增加，且(T2DM+AKI)组较T2DM组增加更明显，说明(T2DM+AKI)小鼠模型复制成功，且高尿酸与高血糖对(T2DM+AKI)有一定的协同作用。与T2DM组、(T2DM+AKI)组比较，白子菜组小鼠肾小球结构清晰，数目明显增多，大小形态恢复正常，肾小球萎缩现象得到一定程度的缓解；空腹血糖、血清BUN和Scr含量明显降低，说明白子菜能够改善(T2DM+AKI)的异常。

还有研究证实，炎症反应是导致 AKI 的重要因素，如 AKI 患者血清TNF-α、IL-1β 及 IL-6 均显著升高[26]。其中，TNF-α介导免疫调节、炎症、生长调节等多方面的效应，可作为诊断早期DN的指标[27]；IL-6 利用自分泌或旁分泌的方式和位于肾小球系膜细胞上的受体相结合，促使细胞外基质的生成及肾小球系膜的增生，引起肾小球硬化症，进而导致DN的发生、发展[28]。还有研究发现，小鼠肾缺血再灌注模型促炎因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等增多，而抗炎因子血红素氧化酶-1(HO-1)、白细胞介素-10(IL-10)等减少，导致促炎与抗炎反应间的不平衡，从而引发肾损伤[29]。本实验研究表明，(T2DM+AKI)小鼠肾组织促炎因子TNF-α、IL-6含量明显增加，而抗炎因子IL-10含量明显减少；给予白子菜干预后，小鼠肾组织促炎因子 TNF-α、IL-6含量明显减少，而抗炎因子IL-10含量明显增加。

综上所述，白子菜对(T2DM+AKI)具有保护作用，表现为同时降低空腹血糖、血清BUN和Scr含量，而其机制可能与抑制炎症反应有关。虽然本研究具体机制尚未清晰，但仍具有一定研究开发前景，对未来进一步研究提供思路。