牙龈卟啉单胞菌GroEL在牙周炎及心血管疾病中的研究进展

闫锐 马哲

牙周炎（periodontitis，PD）是一种与口腔菌群失调相关的慢性炎症性疾病，属于全球第六大流行性疾病，世界上约11%的人口患有严重的PD[1，2]。牙周疾病的研究中发现PD与全身50多种系统性疾病和状态有关，如心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）、癌症、肥胖及阿尔兹海默症等[3]。近年来PD与CVD的关系也已成为研究热点。CVD是心脏疾病和血管疾病的总称，是全世界发病率和死亡率最高的疾病，其最主要的特征性改变为动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）[4，5]。AS最初被认为是脂肪和纤维物质积累的结果，然而越来越多的研究者认为它是一种慢性炎症性疾病，一些感染性疾病，如PD，与AS的发生发展有关[6，7]。

牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）是导致牙周组织发生破坏的最重要的优势菌。大量研究表明P.g不仅参与牙周病期间的炎症和组织破坏，还通过上皮和淋巴管的溃疡进入血液系统，从而与远端身体器官的炎症病理相关，如AS和阿尔茨海默病等[8，9]。P.g发挥致病作用的毒力因子主要包括菌毛、脂多糖、GroEL及蛋白酶等。近年来随着人们对GroEL的研究越来越多，发现它作为局部及全身炎症的有效诱导剂，可能在PD与AS发生发展中起着重要作用，但未有研究对其进行过系统性论述。因此，本综述重点探讨P.g GroEL在PD及CVD中的作用及相关机制，为深入了解P.g在PD与AS中的致病机制和指导临床治疗提供有力的理论依据。

一、GroEL生物学特性

GroEL为细菌内部的伴侣蛋白60或热休克蛋白60（heat shock protein 60,HSP60），在细菌受到高温、紫外线、炎症及组织损伤等刺激时产生，其氨基酸序列具有高度保守性。GroEL在蛋白质折叠、转运、变性蛋白修复和线粒体生物发生过程中都起着重要作用[10]。由于进化过程中高度保守，细菌GroEL与人HSP60之间可存在55%的同源性，在573个氨基酸的结构域上保守序列可达72%[11]。GroEL被广泛认为是各种细菌感染和自身免疫性疾病中的重要分子，已有研究发现一些口腔致病菌的代谢产物GroEL能够刺激促炎细胞因子和黏附因子的的产生。如伴放线聚集杆菌产生的GroEL可刺激单核细胞分泌白介素-10（Interleukin-10，IL-10）、白介素-12（Interleukin-12，IL-12）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α），从而造成牙槽骨吸收[12]。福赛坦氏菌产生的GroEL通过促进炎症因子IL-6、IL-8以及前列腺素的分泌，引起人牙龈成纤维细胞和牙周膜干细胞的炎症反应[13]。Lee等人[14]在ApoE-/-小鼠腹膜内注入具核梭杆菌GroEL，可导致IL-6、C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）和低密度脂蛋白水平（low-density lipoprotein，LDL）升高，高密度脂蛋白水平（high-density lipoprotein，HDL）降低，从而使AS病变进展显著。P.g GroEL也可以刺激人单核细胞和牙龈成纤维细胞产生IL-6和IL-8等炎性细胞因子，并能上调细胞间黏附分子-1（intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管间黏附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）等黏附分子的表达[15]。这些研究表明，细菌产生的GroEL在疾病的发生和进展中起着重要作用。

P.g GroEL是P.g在疾病感染期所分泌的免疫原性致病因子，被认为是PD患者的一种关键的显性抗原。在PD患者的所有牙龈炎症组织及血清中抗GroEL抗体滴度均较健康对照者显著增高，而在牙周治疗后血清中抗P.g GroEL的抗体降低，表明PD患者对GroEL有免疫应答[16]。由于P.g GroEL与人HSP60在进化过程中具有高度的相似性，使人HSP60抗体与P.g GroEL能够发生交叉反应，机体免疫系统在攻击GroEL的同时也能攻击高表达HSP60的内皮细胞，造成内皮细胞的损伤，并加速AS的形成[17]。同时P.g GroEL作为全身炎症的诱导剂，也能够促进内皮细胞炎症因子和黏附因子的产生。这些都说明了P.g GroEL作为细菌感染的重要分子，不仅可以造成牙周组织损伤，在以AS为基础的CVD中也起着重要作用，它可能是连接PD和自身免疫性AS的触发分子。所以研究P.g的代谢产物GroEL为PD与AS之间的联系提供有力的理论依据。

二、P.g GroEL对牙周炎的致病作用

P.g GroEL是一种重要的免疫显性抗原，导致牙周组织炎症发生。GroEL基因在龈下斑块中的转录激活已被证明与PD的探诊深度和疾病状态有关。同时，在Lee等人[18]研究中发现，针对P.g GroEL的疫苗可以减少PD相关牙槽骨的丢失。近年来P.g GroEL对PD的影响多集中在细胞层面，现将P.g GroEL对牙周细胞的影响分述如下。

1.P.g GroEL对牙周膜干细胞的影响

Lin等人[19]研究发现，P.g GroEL可以通过激活NF-κB转录活性通道来促进牙周膜干细胞分泌炎症因子IL-6和IL-8，从而可能造成牙周组织破坏。它也可以显著诱导牙周膜干细胞的迁移，这主要通过激活整合素α1、α2和细胞骨架的重构所引起的。GroEL可能通过激活JNK/MAPK和NF-κB信号通路促进牙周膜干细胞定向成脂分化，并竞争性地抑制其定向成骨分化[20]，这为细菌可以影响干细胞的分化提供了证据，并揭示了GroEL对组织再生的潜在影响。

2.P.g GroEL对骨细胞的影响

破骨细胞和成骨细胞是牙槽骨吸收和形成之间高度动态平衡的主要成分。牙周炎中骨丢失的机制不仅涉及破骨细胞活性的增强，还涉及成骨细胞活性的减弱，从而加剧了牙槽骨的进行性破坏[21，22]。在牙周组织中，P.g GroEL能以浓度依赖性方式诱导成骨细胞分泌骨吸收炎症因子IL-6和IL-8，从而加速牙槽骨的破坏。这是由于激活了炎症通路P38/JNK MAPK，进而刺激成骨细胞下游的炎症反应，但是对成骨细胞的活力并没有影响[23]。在对大鼠体内研究中发现，与对照组相比，P.g GroEL注射组显著诱导了牙龈中破骨细胞的发生。同时该团队还发现P.g GroEL可以从mRNA水平上调核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB Ligand,RANKL）和抑制碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的表达来参与破骨细胞分化[19]。RANKL是TNF家族的成员，可启动破骨细胞相关基因的表达，从而刺激了破骨细胞的形成和分化，增强牙槽骨的吸收[24]。ALP是一种参与各种矿化组织钙化的保守因子，已被用作骨组织中成骨细胞活性的指标[25]。这些数据表明，GroEL不仅影响破骨细胞分化的激活，而且影响成骨细胞活性的抑制。

三、P.g GroEL对心血管疾病的致病作用

P.g GroEL不仅对牙周组织具有破坏性，而且可以诱发和加重全身炎症。其主要通过内皮功能障碍、诱导炎症反应及脂代谢紊乱和分子拟态这三个途径参与AS的发生发展。

1.内皮功能障碍

内皮功能障碍是指内皮细胞各种功能的非适应性变化，被认为是AS的早期病理改变，存在于AS发生发展的整个过程。血管张力调节障碍和粘附分子的表达异常是内皮功能障碍的两个重要表现[26]。

Huang等人[27]用P.g GroEL刺激人冠状内皮细胞8 h、16 h、24 h和48 h，结果表明其对内皮细胞的增殖活性没有影响，但显著增加了ICAM-1和VCAM-1的表达。这些黏附因子的升高能够激发单核细胞及白细胞与内皮结合并入侵血管壁，并最终分化成巨噬细胞，从而参与粥样斑块的形成和发展[28]。WU等人[29]研究发现，P.g GroEL可以通过下调HUVEC中重要的血管内皮钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin,VE-cadherin）和内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）的表达水平，并促进caspase-3的切割，从而诱导HUVEC功能障碍和凋亡。其中eNOS能够调节NO这种舒血管因子的产生，进而在调节血管张力、抑制白细胞-内皮细胞粘附和平滑肌增殖等方面发挥着重要的生理作用[30]。VE-cadherin定位于粘附连接，通过其胞质结构域与α-连环蛋白、β-连环蛋白结合，在调节内皮细胞通透性、新血液的迁移和组装中起着重要作用[31]。

2.诱导炎症反应及脂代谢紊乱

大量流行病学调查、临床及动物实验研究表明，以脂肪功能紊乱为特征的代谢失调和炎症反应在AS病理生理过程中发挥着重要作用。脂代谢紊乱包括循环中一种或多种类型的脂质的不健康水平，如高水平甘油三酯、总胆固醇、小而致密的LDL颗粒数量和低水平的HDL[32]。

Huang等人[27]发现P.g GroEL可能通过上调人冠状内皮细胞膜表面Toll样受体4（Toll-like receptors 4,TLR4）的表达来调节内皮细胞的AS现象。已知TLR4作为一种经典的跨膜蛋白，是先天免疫识别和结合细菌代谢产物的主要受体，体内外配对后通过级联反应，可以激活下游NF-κB和MAPK等转录因子，产生炎症免疫反应，从而促进AS的发生[33]。同时该团队在对小鼠的体内研究中发现，与对照组相比，P.g GroEL注射组可显著增加小鼠血清中总胆固醇和LDL等AS危险因素，从而促进粥样斑块的形成[27]。Joo等人[34]的一项研究表明，来自P.g HSP60的肽（Peptide,Pep）19诱导LDL氧化的能力与P.g HSP60驱动的LDL氧化相当，都显著大于对照组，这说明了P.g HSP60中的Pep19可作为LDL氧化的诱导剂。氧化LDL是AS的一个危险因素，它作为巨噬细胞的清道夫受体，可诱发巨噬细胞转变为泡沫细胞。此外氧化LDL还可以通过氧化应激诱导内皮功能损伤、平滑肌细胞迁移，从而在AS中发挥重要的作用[35]。

3.分子拟态

分子拟态是指结构相似的表位可能通过交叉性免疫反应在疾病过程中发挥作用。病原微生物和同源宿主蛋白之间的分子拟态是导致自身免疫性AS发生的可能机制之一[36，37]。

正常情况下，人血管内皮细胞上不表达HSP60，但在各种应激条件刺激下，线粒体HSP60易位至细胞质，然后表达至细胞表面。由于P.g GroEL与人HSP60在进化过程中氨基酸具有高度的相似性，使人HSP60抗体与P.g GroEL能够发生交叉反应，机体免疫系统在攻击GroEL的同时亦能攻击高表达HSP60的内皮细胞，造成内皮细胞的损伤，从而加速AS的发生[38，39]。Jeong等人[40]发现，P.g HSP60中不同表位Pep可能在AS中分别作为自身免疫反应的效应因子和调节因子，用Pep14免疫的小鼠斑块/脂滴面积和血清总胆固醇水平较对照组显著降低，而用Pep19免疫的小鼠则明显相反。

四、P.g GroEL疫苗在牙周炎及心血管疾病中的治疗及预防价值

目前的研究已证明了P.g GroEL作为一种重要的毒力因子，能够加速PD及AS的进展。而P.g GroEL免疫可能会诱导PD及AS的保护反应，所以其在治疗及预防疾病中的相关研究也受到越来越多的关注。

Chang等人[41]对BALB/c小鼠注射P.g之前，先对其舌下免疫了P.g GroEL及CpG-ODN佐剂，结果显示，舌下免疫GroEL组与对照组相比，可以有效抑制牙槽骨的吸收及炎症因子TNF-α、IL-6的分泌，这与Lee等人[18]的研究结果相一致。这说明了P.g GroEL可以作为一种有效的牙周疫苗来治疗及预防PD的发生。Joo等人[42]在最近的研究中发现，与对照组相比，鼻免疫P.g HSP60 Pep14可使ApoE-/-小鼠粥样斑块明显减少。此外，Hagiwarar等人[43]在对ApoE-/-小鼠进行了舌下免疫GroEL后，显著减少了主动脉窦粥样斑块的形成，并降低了血清中CRP、MCP-1和氧化LDL水平。这些研究结果表明，虽然P.g GroEL引起AS的机制尚未完全清楚，但设计一种基于GroEL的疫苗可能是治疗及预防P.g相关性AS的可行策略。

五、总结与展望

综上所述，GroEL作为P.g重要的毒力因子，不仅与PD密切相关，在全身性疾病如AS的发生发展中也有着重要的作用，但目前对P.g GroEL的研究还处于初级阶段，具体发病机制仍需进一步研究。近年来除了研究P.g GroEL对PD和AS的影响，还发现了其在肿瘤发展中的作用。Lin等人[44]通过研究携带C26癌细胞的BALB/c小鼠，发现P.g GroEL可以加速BALB/c小鼠的肿瘤生长并增加了死亡率，这是由于eNOS的产生和p38/MAPK的激活介导所引起的，但对P.g GroEL与全身其它系统性疾病的研究仍存在大量空白。这些研究的开展会有助于我们更深入理解牙周炎与全身系统性性疾病的关联，从而能为临床上提供新的治疗思路，并提高人们对口腔健康的重视程度。